一株新型嗜熱耐鹽降解原油產乳化劑的菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于能源生物技術和環境生物技術領域，具體地說，本發明是關于一株不 產氧芽孢桿菌（Anoxybacillusrupiensis)及其應用，該菌株能以原油和糖蜜為碳源和能 源生長，同時產生生物乳化劑，該菌株及其產生的生物乳化劑可用于微生物采油，提高采油 率。
【背景技術】
[0002] 石油是一種非再生資源，隨著石油資源的日益短缺和勘探費用的不斷增加，經 過一次采油和二次采油后，地層中仍然有約60% -70%的緣由無法開采出來。石油的短 缺已逐漸不能滿足人們對石油資源有增無減的需求。近年來，以微生物提高原油采油率 (MicrobialEnhancedOilRecovery，ME0R)技術為代表的三次采油方法正逐漸受到廣泛 重視。該技術利用微生物的有益活動及代謝產物來提高原油采收率，是繼熱力驅、化學驅、 聚合物驅等傳統"三采"方法之后的一項綜合性技術。
[0003] 微生物采油技術是一項科技含量高、發展迅猛的新技術，是現代生物和技術在采 油工程領域中開拓性的應用，對于高含水和接近枯竭的油田更顯示出了強大的生命力。微 生物米油技術主要包括兩類（RonaldM.Atlas.PetroleumMicrobiology[M].Newyork. Macmilanpress):-類是利用微生物代謝產物如生物聚合物和生物乳化劑作為油田化學 劑進行驅油，稱為微生物地上發酵提高采收率工藝，即生物工藝法。目前該技術在國內外已 趨向成熟；另一類是利用微生物及其代謝產物提高采收率，主要利用微生物地下發酵和利 用油層中固有的微生物的活力，稱為微生物地下發酵提高采收率方法。
[0004] 微生物以原油烴為碳源，代謝出生物乳化劑，生物乳化劑（如糖脂、磷脂、脂肽、月旨 肪酸、短肽等）是一些低分子量的小分子，它們能顯著降低空氣一水或油一水界面的張力， 從而有助于油水乳化，使得烷烴呈膠狀分散，增加了烷烴與細胞的接觸，提高微生物對烴的 降解效率。
[0005] 降解石油和高產有利代謝產物的微生物的分離是實現微生物強化采油技術的基 礎，菌種的好壞是微生物采油的關鍵。目前已分離得到的一些石油微生物中，能在好氧或厭 氧條件下降解原油的嗜熱耐鹽同時能夠產生物乳化劑的菌種不多。尋找合適的微生物仍是 本領域當前的一項重要工作。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于針對微生物采油現狀，基于微生物采油的機理，提供一株能產 生生物乳化劑的菌株，該菌株同時具有很好降解和乳化原油的能力，改變原油流變性。
[0007] 本發明提供了一株能夠在好氧或者厭氧條件下降解原油且產生乳化劑的菌株，其 是一株不產氧芽孢桿菌（Anoxybacillusrupiensis)，本發明命名其為WJ-4。該菌株已于 2012年09月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市 朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所），保藏編號：CGMCCNo. 6614。該菌 株能夠以廢棄原油和糖蜜為碳源和能源生長，并合成生物乳化劑；該生物乳化劑具有很強 的乳化能力、有效的提高烷烴或原油在水中的溶解度、明顯促進菌株對原油的降解，該菌株 及其產生的生物乳化劑可用于微生物采油。
[0008] 本發明的AnoxybacillusrupiensisWJ-4是從大慶九廠的油水樣中分離得到 的。參考《常見細菌系統鑒定手冊》，根據WJ-4的生理生化特征，以及16SrDNA基因序列 在Genbank數據庫中BLAST比對的結果，可鑒定WJ-4為不產氧芽孢桿菌（Anoxybacillus rupiensis)。WJ-4的生理生化特征，以及16SrDNA基因序列如下：
[0009] WJ-4菌在固體LB培養基上65°C培養ld，菌落呈圓形，乳黃色，隆起凸狀，邊緣 整齊，表面濕潤。在光學顯微鏡1000倍下觀察，菌體呈短桿狀，細胞大小為（0. 5?1. 0) ymX(3. 2?5. 4)ym，有側生鞭毛，產生芽孢，革蘭氏染色為陽性，菌體染色和電鏡圖片見 圖1。該菌均在50?80°C和0?15%NaCl溶液中生長良好，其最適生長溫度為65°C，最適 鹽的質量分數為3. 0%，見圖2和圖3。觸酶、H2S實驗、淀粉水解、纖維素水解、甲基紅（MR) 實驗均為陽性；苯丙氨酸脫氨、尿酶實驗、氧化酶、溶菌酶抗性實驗、絡氨酸降解、吲哚實驗、 明膠水解、絡蛋白水解、V-P實驗都為陰性，兼性好氧。
[0010] WJ-4菌的16SrRNA基因序列特征：用大連寶生物公司生產的DNA快速提取試劑盒 提取菌株WJ-4總DNA，采用大腸桿菌通用引物：27F, 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（SEQID 吣.2);14921?，5'-〇6611^〇：11^11^〇6六(：1'1'-3'（5￡0 10吣.3)，對町-4菌株165汕嫩序列進 行PCR擴增，反應體系（100yL)為：模板DNA1yL，Taq10x緩沖液 10yL，dNTPlOOmol/ L，DNA聚合酶2. 5U，引物各lyL。聚合酶鏈反應（PCR)條件為：于94°C預熱5min;于94°C 變性30s，于58°C退火45s，于72°C延伸1. 5min并循環30次；于72°C延伸10min。然后， 將PCR產物與pMD18-T載體連接，轉化到大腸桿菌DH5a感受態細胞中，篩選陽性重組子送 大連寶生物公司測序，序列見SEQIDNo. 1。將整個序列提交到NCBI數據庫GenBank進行 Blast比對發現：WJ-4與Anoxybacillusrupiensis菌株的最高同源性為99%。
[0011] 本發明還提供了一種不產氧芽孢桿菌制劑，該不產氧芽孢桿菌制劑中含有保藏編 號為CGMCCNo. 6614的不產氧芽孢桿菌，該不產氧芽孢桿菌制劑為固態或液態菌制劑。
[0012] 本發明還提供了所述的不產氧芽孢桿菌或所述的不產氧芽孢桿菌制劑在以廢棄 原油和糖蜜為碳源發酵培養生產生物表面活性物質中的應用。
[0013] 本發明還提供了一種生物乳化劑，其是利用所述的不產氧芽孢桿菌或所述的不產 氧芽孢桿菌制劑發酵培養而得到的。
[0014] 本發明還提供了一種生產生物乳化劑的方法，該方法包括：利用所述的不產氧芽 孢桿菌或所述的不產氧芽孢桿菌制劑以廢棄原油和糖蜜為碳源進行發酵培養，離心除去菌 體，將上清液用硫酸調pH至2. 0以下，并加入硫酸銨靜置，再用氯仿和甲醇的萃取液等體積 萃取上清液，靜置分層后，取下層，去除其中溶劑，制備得到生物乳化劑。具體地，該方法中， 所述發酵培養條件優選為：發酵培養基為：廢棄原油5?10g/L、糖蜜l-3/L，NH4N03l?4g/ L、酵母膏 1 ?2g/L;K2HP043. 5g/L、MgS040. 2 ?0? 5g/L、pH7. 0 ?8. 0 的培養基中，50 ? 70°C，100?300rpm搖床培養90?180小時。
[0015] 本發明還提供了按照該方法制備得到的生物乳化劑。
[0016] 本發明還提供了所述的不產氧芽孢桿菌或所述的不產氧芽孢桿菌制劑在降解原 油和采油中的應用。
[0017] 本發明還提供了所述的不產氧芽孢桿菌、所述的不產氧芽孢桿菌制劑、或者所述 的生物乳化劑在驅油中的應用。具體的，在應用時，是將所述的不產氧芽孢桿菌在含有廢棄 原油 5 ?10g/L、糖蜜 1-3/L，NH4N031 ?4g/L、酵母膏 1 ?2g/L;K2HP043. 5g/L、MgS040. 2 ? 0? 5g/L、pH7. 0?8. 0的培養基中，50?70°C，100?300rpm搖床培養90?180小時后， 將其發酵液用于驅油以提高原油采收率。
[0018] 本發明的WJ-4菌能夠在高溫高鹽度的環境下生長和代謝，在好氧或厭氧條件下 具有很好的降解原油的能力。用WJ-4菌株生長細胞進行對好氧和厭氧的原油降解實驗的 結果表明：WJ-4可有效降解并乳化原油，未接入菌體的原油培養基恒溫培養后的水相仍然 是清澈的，油相呈大片油塊漂浮在水溶液上層或黏附在瓶壁，兩相完全隔離，油水界面清 晰。接入菌體的原油培養基培養l〇d后，油層分散在水相中呈細末狀，瓶壁上沒有黏附原 油，水相呈棕黑色，油水界面不清，靜止后不分層。WJ-4對大慶稀油的降解率為33. 2 %。
[0019] 本發明提供的WJ-4菌株能夠以廢棄原油和糖蜜為碳源的基礎培養基中發酵培養 生產生物乳化劑。培養基組成為（g/L):廢棄原油5?10g/L、糖蜜l-3/L，NH4N03l?4g/L、 酵母膏1?2g/L;K2HP043. 5g/L、MgS040. 2?0? 5g/L、pH7. 0?8. 0。所產生的生物乳化劑 可以使去細胞去殘余油的培養液的96小時乳化系數EI96仍可以達到95%，且乳化非常穩 定，表現出很強的乳化活性。
[0020] 本發明的WJ-4菌株產生的生物乳化劑，進行TLC實驗，用硫酸-蒽酮顯色后呈藍 綠色，說明乳化劑樣品中含有糖類成分；用茚三酮顯色呈紅色，說明表面活性劑樣品中含有 蛋白組分；表面活性劑樣品的丁酮抽提物用鉬酸銨-高氯酸顯色呈藍-黑色斑點，說明表面 活性劑樣品中含有脂類物質。WJ-4代謝產生的表面活性劑主要為糖類，可能是糖蛋白類生 物乳化劑。
[0021] 本發明的WJ-4菌所產的生物乳化劑具有很強的乳化活性，96小時乳化系數高達 95%，其降低表面張力的能力較弱，可見其主要起乳化穩定的作用。該結果表明能產生生物 乳化劑的嗜熱耐鹽WJ-4菌株至今未見國內外的相關技術報道。
[0022] 本發明的WJ-4菌株所產生的生物乳化劑具有明顯的乳化能力。目前國際上對乳 化能力的測定，通常以煤油為乳化對象，在帶刻度的試管中，加入5mL測試煤油和5mL乳 化活性物質溶液，禍旋振蕩器充分振蕩2min，靜置一定時間，以乳化指數（Emusification index，EI)表示乳化劑的乳化活性。EI為油水界面上層高度占總高度的百分數。結果表明， 靜置96小時后EI系數可以達到95%，且相對穩定，可見WJ-4產生的表面活性劑具有很高 的乳化能力。<