一種具有產酸功能的微生物菌及其應用的有機肥料的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種微生物菌，尤其涉及一種發酵產酸、耐堿和抗生素的能力的解淀 粉芽孢桿菌及其制成的有機肥料及應用。
【背景技術】
[0002] 解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，在其自身的生長過程 中可以產生一系列的代謝產物，這些代謝產物使得解淀粉芽孢桿菌能夠具有廣泛地抑制真 菌和細菌的活性。因此，近些年大量學者在對解淀粉芽孢桿菌的新發現與新應用以及基因 功能研宄和發酵條件的優化做了大量的探索。解淀粉芽孢桿菌能產生多種抗菌物質，殺菌 譜廣，對病原菌具有防治作用，故其防治作物、蔬菜、瓜果病害效果非常顯著，市場發展前景 巨大，更為重要的是，其為減少化學農藥、保證食品安全提供了一條有效途徑。
[0003] 我國北方地區堿性土壤較多，而由于常年大量使用化學肥料，很多大棚內的土壤 頻頻出現"紅霜"、"白堿"，這都是土壤偏堿的癥狀。堿性土壤改良技術主要包括改良土壤， 培肥地力，增強土壤的親和性能，如施入腐熟的糞肥、泥炭、鋸木肩、施用酸性肥料，如硫酸 鉛、硫酸亞鐵、硫磺粉、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、過磷酸鈣、磷酸二氫鉀、硫酸鉀等，定向中和 堿性等。雖然以上方法改良土壤堿性見效快，但作用時間不長，需經常重復施用。結合有機 肥的生物發酵，篩選產酸的解淀粉芽孢桿制作生物菌肥，可以通過微調根際土壤的微生態 PH，解決堿性土壤作物根系生長微生態環境，從而促進作物健康生長。
【發明內容】
[0004] 針對上述問題，本發明旨在提供一種產酸能力強、生長速度快、對環境適應性強和 耐逆性強的微生物菌，通過菌株產酸改善堿性土壤作物根際微生態pH及抑制土壤病害生 長，從而能夠顯著提高蔬菜及作物產量和品質的微生物有機肥料及應用。
[0005] 為實現該技術目的，本發明的方案是：一種具有產酸功能的微生物菌，包括菌株 WSA061，為解淀粉芽抱桿菌（Bacillusamyloliquefaciens)，保藏號為CGMCC10070;
[0006] 菌株WSA061的形態及生理生化特性如下：
[0007] 菌株WSA061為革蘭氏陽性菌，細胞呈桿狀，能夠產生芽孢；
[0008] LB瓊脂平板上生長速度快，菌落圓形，中間小凸起（37°C，生長36小時），乳白色不 透明，菌落直徑3-7毫米。細胞桿狀，大小2.8-4. 2x1.5-1. 8ym，具端生鞭毛。最適生長溫 度是28-37°C及最佳生長pH值6-8 ;
[0009] 兼性厭氧，能在以糊精，D-葡萄糖，D-半乳糖，山梨糖，L-果糖，D-果糖，纖維二 糖，松三糖，松二糖，海藻糖，甘露醇，L-阿糖醇，D-阿糖醇，山梨醇，己六醇，半乳糖醇，山梨 糖醇，葡萄糖酸鈉，琥珀酸鈉，乳酸鈉，蘋果酸，甘油，D-葡萄糖醛酸鈉，丁二胺，N-乙酰葡萄 糖胺，L-谷氨酰胺，L-丙氨酸，L-組氨酸，L-色氨酸，L-胱氨酸為唯一碳源的培養基上生 長；
[0010] pH生長范圍較廣，可耐PH3-PH9;對NaCl敏感，NaCl濃度低于1.0%可生長；對 300yg/mL的氨芐青霉素、鏈霉素、四環素、紅霉素仍有耐受性，耐慶大霉素可達100yg/mL，而對卡拉霉素、氯霉素、新霉素的耐受性差，低濃度（50yg/mL)的這幾種抗生素就能抑 制其生長；剛哚反應呈陽性，且能分泌生長素IAA。
[0011] 所述菌株WSA061含量為1.5X108cfu/ml以上，全氮含量質量比為3?7%，總氮 磷鉀養分質量比為5?11 %、有機質含量質量比不低于40%。
[0012] 菌株WSA061制成的有機肥料在油麥菜和玉米栽培中的應用。
[0013] 本發明涉及的產酸功能的微生物菌及其制備有機肥具有如下有益效果：
[0014] 1.菌株WSA061為一種發酵產酸功能的解淀粉芽孢桿菌，在不同的發酵條件下均 可產酸，相對于無機鹽，產酸持久，無需經常施加，而且不會出現陰離子富集而產生的土壤 結塊等問題，同時能夠優化堿性土壤作物根系生長微生態環境。
[0015] 2.菌株WSA061來源于貧瘠土壤玉米根際土壤中，能夠明顯促進油麥菜、玉米等作 物對堿性土壤的耐受性，提高土壤尿酶活性，為油麥菜、玉米等作物在堿性土壤中生長提供 了一種優良的液體菌肥。
[0016] 3.菌株WSA061制備的有機肥能夠明顯的提高油麥菜、玉米等作物的葉片組織的 葉綠素含量、葉片Vc含量、以及產量，具有增加質量增加產量的良好效果。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
[0018] 本發明的具有產酸功能的微生物菌是通過采用80°C處理殺死非芽胞桿菌，用改良 MRS培養（1L):蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫二銨2.0g，葡萄糖20g，磷酸氫 二鉀2g，硫酸銨1. 63g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0. 58g，硫酸錳0. 25g，吐溫80mL，碳酸鈣lg，瓊脂 18g，加蒸餾水至1000mL，pH6. 4 士 0. 2,分別在厭氧和好氧條件下培養。從廣州貧瘠的土 壤上生長的玉米植物中分離、純化獲得8株產酸的芽孢桿菌。對8株菌的發酵產酸能力進 一步篩選，得到生長速度快，產酸能力強，且在不同培養基配方下均能夠產酸，產酸穩定的 菌株WSA061 ;該菌株作為接種劑，施用堿性土壤，微調土壤微生態pH，促進油麥菜、玉米等 作物的生長。
[0019] 一、具有產酸功能的微生物菌一菌株WSA061 :
[0020] 菌株WSA061，為解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens)，保藏號為 CGMCC10070,保藏日期為2014年11月27日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研宄所。
[0021] (一）、菌株WSA061的形態及生理生化特性
[0022] 菌株WSA061為革蘭氏陽性菌，細胞呈桿狀，能夠產生芽孢；
[0023] LB瓊脂平板上生長速度快，菌落圓形，中間小凸起（37°C，生長36小時），乳白色不 透明，菌落直徑3-7毫米。細胞桿狀，大小2.8-4. 2x1.5-1. 8ym，具端生鞭毛。最適生長溫 度是28-37 °C及最佳生長pH值6-8 ;
[0024] 兼性厭氧，能在以糊精，D-葡萄糖，D-半乳糖，山梨糖，L-果糖，D-果糖，纖維二 糖，松三糖，松二糖，海藻糖，甘露醇，L-阿糖醇，D-阿糖醇，山梨醇，己六醇，半乳糖醇，山梨 糖醇，葡萄糖酸鈉，琥珀酸鈉，乳酸鈉，蘋果酸，甘油，D-葡萄糖醛酸鈉，丁二胺，N-乙酰葡萄 糖胺，L-谷氨酰胺，L-丙氨酸，L-組氨酸，L-色氨酸，L-胱氨酸為唯一碳源的培養基上生 長；
[0025]pH生長范圍較廣，可耐pH3_pH9;對NaCl敏感，NaCl濃度低于1.0%可生長；對 300yg/mL的氨芐青霉素、鏈霉素、四環素、紅霉素仍有耐受性，耐慶大霉素可達100yg/ mL，而對卡拉霉素、氯霉素、新霉素的耐受性差，低濃度（50yg/mL)的這幾種抗生素就能抑 制其生長；剛哚反應呈陽性，且能分泌生長素IAA。
[0026](二）、本發明解淀粉芽孢桿菌WSA061的分子分類地位的確定
[0027] 采用細菌16SrDNA基因通用引物25f和1492r進行擴增，將PCR產物直接進行序 列測定，將獲得的DNA序列輸入GenBank進行比對，初步確定本發明的解淀粉芽孢桿菌在 分類學中的菌株種屬的位置。結果發現本