一株高產油柵藻sdec-13及其培養方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微藻生物技術領域，特別涉及一株高產油柵藻SDEC-13及其培養方法 和應用。
【背景技術】
[0002] 能源短缺和二氧化碳過度排放是當今世界兩大突出的環境問題。
[0003] 隨著社會經濟的飛速發展，初級能源消耗量持續增加，能源缺口逐年擴大，同時由 于化石燃料的燃燒，過多的二氧化碳排放到大氣中導致全球溫室效應。作為一種可再生能 源，生物柴油有同時解決這兩個問題的潛力。藻類是一種非常高效的生產生物柴油的原料。 它的優勢有：1、生長速率快，一般十幾天就能收獲；2、可以在無法種植糧食的廢水中進行 培養，不占用耕地面積；3、畝產量可以達到傳統生物柴油原料玉米的172倍；4、由于高生長 速率，其具有更高的二氧化碳固定效率。利用微藻生產生物柴油必須保證充足的碳源和氮 源，由此造成的高培養成本是制約微藻生物柴油規模生產的主要因素。
[0004] 為實現能源微藻油脂的高效積累及生產，國內外就富油微藻篩選，高密度、高油脂 含量微藻的培養等方面進行了研宄。目前針對提高油脂含量的研宄主要集中在微藻的最優 生長條件上，包括光照強度、光質、pH值、培養基（營養物質）、溫度等影響產油藻類的生長 因子、以及反應器設計和營養方式等方面。目前利用廢物培養微藻以降低培養成本成為當 前能源微藻資源開發研宄中的熱點和難點。
[0005] 熱電廠廢氣中含有大量的二氧化碳和一氧化氮，如果能利用電廠廢氣養藻，不僅 可以降低微藻生物柴油的生產成本，還可以處理電廠廢氣。二氧化碳是微藻能夠有效利用 的無機碳源，廢氣中的一氧化氮容易被氧化成二氧化氮，二氧化氮易溶于水且生成硝酸根， 可以無機氮源供微藻利用。但是高濃度的二氧化碳和氮氧化物對藻類有一定的毒性，而不 同的藻種呈現不同的耐受性。據報道有些球藻和柵藻能夠在濃度30% (v/v)以上的二氧化 碳環境快速生長，小球藻對〇. 2%的一氧化氮具有耐受性。因此篩選能夠耐受這些煙氣的藻 種是使用電廠廢氣養藻的首要而關鍵的一步。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于克服現有技術中用于生產微藻油脂的優良藻株不足和培養成 本高的問題，提供一株高產油柵藻及其利用工業廢氣的培養方法，即在自然水體采集水樣， 分離純化獲得一種具有油脂含量較高（27% )、易開放培養的產油微藻，并建立培養方法。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的：
[0008] 一株高產油柵藻SDEC-13,為ScenedesmusquadricaudaSDEC-13,其保藏編號為 CCTCCNO:M2014498,保藏日期為2014年10月19日，保藏單位為中國典型培養物保藏中 心。柵藻SDEC-13富含優質油脂，油脂含量可達到細胞干重的30. 75%，脂肪酸中飽和脂肪 酸可達到82. 87%，可作為生物柴油原料。十六烷值（57)高于歐洲標準（51)和碘值（83. 36g I2/l〇〇g)決定了以該株微藻為原料制備的生物柴油具有很好的氧化安定性。
[0009] 所述的高產油柵藻SDEC-13,其核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
[0010] 本發明還提供了一種上述的高產油柵藻SDEC-13培養基，其成份和用量 為NaN032.5g L'l^HPC^O.OTSg L'MgSC^.THW 0.075g L'CaCL.〗％。0.025g L' KH2P040. 175g I71，NaCl 0? 025g I71，土壤提取液40ml L' FeCl3 ? 6H200. 005g L' Fe-EDTA lml I71，H3B032. 86mg ? I71，MnCl2 ? 4H20 1. 86mg ? I71，ZnS04 ? 7H20 0? 22mg ? I71， Na2Mo04 ? 2H20 0? 39mg ? I71，CuS04 ? 5H20 0? 08mg ? I71，Co (N03) 2 ? 6H20 0? 05mg ? I71，初始pH 值在7?7. 5之間，接種后的藻細胞密度為0. 35?0. 40 X 106celIs. mL-1。
[0011] 所述土壤提取液的制備方法為：稱取200g富含腐殖質的土壤，加入1L純凈水；持 續煮沸lh后靜止3h，重復三次；過濾即得。
[0012] 上述的高產油柵藻SDEC-13培養基的應用，其特征在于，所述的培養基培養高產 油柵藻SDEC-13,得到高產油柵藻SDEC-13藻粉。所述高產油柵藻SDEC-13藻粉的飽和脂肪 酸含量為82. 87%，十六烷值為57,碘值為83. 36gI2/100g。
[0013] 本發明提供了一種培養上述高產油柵藻SDEC-13的培養方法，包括如下步驟：
[0014]a)將高產油柵藻SDEC-13培養于添加BG11的培養基中，培養溫度為25±1°C，全 光照，光照強度2000-3000Lux，培養7天；
[0015] b)將所得藻細胞轉移至SE培養基中進行擴大培養，曝氣氣液比為0.1-0. 2vvm，氣 體為空氣、含有15% C02的空氣或含有15%〇)2和0.2% NO的空氣，培養溫度為25±1°C， 全光照，光照強度2000-3000LUX，待高產油柵藻SDEC-13生長到穩定期離心、干燥即得到培 養后高產油柵藻SDEC-13藻粉。上述的百分數皆為體積百分數。
[0016] 上述的高產油柵藻SDEC-13在處理污水和/或廢氣中的用途。所述處理為凈化。
[0017] 進一步地，所述污水為工業廢水或城市生活污水，所述廢氣為工業廢氣。
[0018] 上述的高產油柵藻SDEC-13在制備生物柴油和/或油脂中的用途。
[0019] 本發明由于采取以上技術方案，其具有以下優點：
[0020] 1、本發明提供的藻種可以利用廢氣中高濃度co2從而降低培養成本。本發明柵 藻富含優質油脂，總油脂含量可達干重的27. 2%，脂肪酸中飽和脂肪酸含量最高可達到 82. 87%，脂肪酸成分中，碳鏈長度為16-18的脂肪酸含量可達98%以上，適合作為生產生 物柴油的原料。
[0021] 2、本發明提供的柵藻SDEC-13能夠耐受高濃的二氧化碳和有毒氣體一氧化氮。因 此柵藻SDEC-13能夠利用工業廢氣中的二氧化碳進行培養，降低生產成本。本發明提供的 柵藻SDEC-13含油量豐富，所含生物柴油品質高，重力學粘度、比重、十六烷值等生物柴油 指標均符合國家和國際標準。
【附圖說明】
[0022] 圖1為柵藻SDEC-13的光學顯微鏡照片和掃描電鏡照片。
[0023] 圖2為基于18SrRNA部分序列構建的系統發育樹。
[0024] 圖3為不同曝氣成分條件下，柵藻SDEC-13的生物量隨時間的變化。
【具體實施方式】
[0025] 以下通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規的方法和條件進行選 擇。
[0026] 實施例1
[0027] 藻種的獲得和鑒定
[0028] 一、樣品采集
[0029] 2012年11月從山東省濟南市山東建筑大學人工湖采集富含微生物的水樣。
[0030] 二、柵藻SDEC-13的分離純化和篩選
[0031] 水樣經過富集培養后，在顯微鏡下對藻細胞進行計數。根據計數結果將水樣稀釋 至其中的藻細胞濃度約為1個/50微升。在無菌環境下，向96孔板的每個孔中加入50微 升水樣，再加入200微升BG11培養液，BG11培養基成分為：NaN03l. 5g/L，K2HP040 . 04g/ L,MgS04?7H20 0. 075g/L,CaCl2 ? 2H20 0. 036g/L,Citricacid0. 006g/L,Ferricammonium citrate0. 006g/L,EDTANa0.OOlg/L,NaC030. 02g/L,A5tracemetalsolution1ml/ L.TheA5tracemetalsolutionwascomposedofH3B032. 86g/L,MnCl2 ? 4H20 1. 86g/ L,ZnS04 *7H20 0. 22g/L,Na2Mo04 *2H200. 39g/L,CuS04 *5H20 0. 08g/L,Co(N03)2 *6H20 0. 05g/ L。將96孔板放在培養箱內進行恒溫培養，大約十余天后96孔板的孔內生長出藻類群落。 在無菌環境中將96孔板中的藻分別轉移至裝有10mLBG11培養基的試管中，繼續在培養 箱中培養至試管中藻液變綠。然后對試管中藻液在顯微鏡下進行鏡鑒，將純的藻種進行保 存。
[0032] 將這些純的藻種分別進行曝氣培養，選出生長狀況較好同時油脂含量較高的一株 為目標藻種。命名為SDEC-13。
[0033] 三、柵藻SDEC-13的鑒定
[0034] 1、柵藻SDEC-13的形態學鑒定
[0035] 使用光學顯微鏡（CX31，OLYMPUS,Japan)在放大四百倍條件下觀察柵藻SDEC-13 的藻細胞特征。藻細胞具有典型的柵藻細胞形態特征，細胞呈長圓形，單個細胞長度約為 5?10微米。通常以兩個或四個的細胞群體狀態存在，四個角都長有脊刺，圖1為柵藻 SDEC-13的光學顯微鏡照片和掃描電鏡照片。
[0036] 2、柵藻SDEC-13的分子生物學鑒定
[0037] 離心收集對數生長期的藻細胞，使用DNeasyPlantMiniKit試劑盒提取基因組 總DNA，對其進行18SrDNA擴增。PCR擴增體系為50yL，其中包括TaqPCRMasterMix 25 1^，0嫩樣品11^，上游引物（1〇1^)2 1^，下游引物（1〇1^)2 1^，(1(11120 2〇1^。？0?擴 增程序為：94°C預變性lmin;94°C變性lmin，55°C復性lmin，72°C延伸1. 5min，重復30個 循環；72°C延伸10min。
[0038]上下游引物分別為：CTGGTTGATCCTGCCAG(18S-F)和 TTGATCCTTCTGCAGGTTCA(18S-R)。
[0039] PCR擴增產物交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。PCR擴增產物為18S rDNA的部分序列，長度為1046bp測序結果如SEQIDNo. 1所示。
[0