一種以1,4,7,10-四氮雜環十二烷為骨架的手性順磁探針的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于化學生物學研宄中的高性能探針，特別是一種以1，4, 7, 10-四氮雜 環十二烷（cyclen)為骨架的手性順磁探針。
【背景技術】
[0002] 蛋白質空間結構是其生物功能的基礎。順磁效應下的核磁共振由于其獨特的性 質，近年來在生物大分子(如蛋白質、DNA、RNA等）的結構和功能研宄中發揮著越來越強大的 作用；順磁效應能夠提供其它技術手段難以獲得的大分子長程結構信息；功能化的順磁標 簽則是順磁技術中修飾蛋白質最為重要的技術手段之一。
[0003] 順磁標簽的質量對利用順磁核磁研宄生物大分子的結構與動態學關系起著決定 性的作用。順磁標簽一般均是一些具有雙功能團的小分子探針，一端用于順磁金屬離子的 螯合，另一端則用于與蛋白質連接。將順磁標簽與生物大分子連接后，利用順磁效應可以 揭示生物大分子的作用機制和作用構象變化、小分子與大分子作用的高分辨結構(參見a 遍/?，2010，46: 101-112)，這將對有效藥物先導分子進行篩選與優化起到重要 的導向作用。
[0004] 一個好的標簽通常需要需要滿足以下條件：1)標簽連接的剛性。當標簽與順磁金 屬離子結合后，若此順磁標簽和蛋白質的相對位置發生變化，會使PCS (贋接觸化學位移)和 RDC (殘余偶極耦合）明顯降低；2)光學純度單一，金屬離子和具有多個潛在手性中心的標 簽結合后，會產生對映異構體，導致出現多套NMR信號，進而使圖譜變得復雜而難以解析； 3)標簽與蛋白鏈接的穩定性。
[0005] Su 等（2006，7: 1599 - 1604.)，首先用 Ellman's 試劑 5, 5'-二硫 代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB)活化蛋白質的巰基形成二硫鍵，過量的DTNB通過透析除去； 之后加入等量的標簽，標簽中的巰基即和活化的二硫鍵反應生成新的二硫鍵，最終把多肽 標簽和蛋白質連接起來(反應過程見圖1)。離去的5-巰基-2-硝基苯甲酸（TNB)呈現明顯 黃色，這為反應過程的檢測提供了很大的便利。這種標記方法產率較高（>70%)，因為LBT多 肽標簽酸性很強，與蛋白質連接之后其pi值會明顯改變，所以可以通過離子交換色譜柱將 連接產物和未連接蛋白質分離。然而，二硫鍵不穩定，這阻礙了此類標簽的廣泛應用。
[0006] Prudencio 等?及/r. J，2004，10(3) : 3252 ?3260.)報道了具有兩個活 性巰基的化合物L-1(見圖2)，其由DTPA雙酸酐和S-(2-氨乙基）甲烷硫代磺酸反應得到， 合成方法簡單。此標簽可以和蛋白質上距離8?10A的兩個半胱氨酸殘基同時反應，形成 兩個二硫鍵，增加了標簽的剛性，限制了標簽相對于蛋白質的運動，避免了 PCS的平均化， 在距離順磁金屬離子4nm處仍有明顯的PCS。但是由于其存在多個手性中心，與蛋白質連接 以后，滴加順磁金屬離子，會產生至少5個順磁信號峰，致使屯- 1% HSQC譜圖非常復雜。
[0007] Li等（泛挪.Cb遞w/7.，2012，48: 2704 - 2706.)首次報道了利用末端烯鍵與蛋 白質側鏈巰基的邁克爾加成反應將化合物L-2 (見圖2)定點標記到蛋白質上，加成產物含 有硫醚鍵，它可以在還原性環境和堿性條件下穩定存在。然而化合物L-2只有三個配位點， 鑭系金屬離子和其配位以后，還能結合其他配位原子。
[0008] Vlasie等（^e??及/r. 7；，2007，13(6) : 1715?1723.)報道了化合物L-3(見 圖2)，它通過兩個二硫鍵和蛋白質上的兩個巰基連接，這種連接方式增加了標簽的剛性，降 低了順磁標簽相對于蛋白質的運動。但是作者發現L-2和蛋白質連接以后，滴加順磁金屬 離子，HSQC中部分殘基有兩個順磁信號，說明標簽和順磁金屬離子配位以后，存在不止一種 構象。
[0009] leizeYs等ij. Am . Chem. Soc.，2QQ7，YZ9.. 9292 - J. Am. Chem .5bc.，2008，130: 14802 - 14812.)報道了化合物 L-4 和 L-5(見圖 2)，他們在 cyclen 中 引入了兩個吡啶氮氧化物，吡啶氮氧化物的引入改變了 L-4和L-5與鑭系金屬離子的配位 環境。它們與蛋白質連接后，1H-15N HSQC譜圖中只有一套PCS，這說明L-4和L-5與鑭系金 屬離子配位以后只有一種構象。L-4通過兩個二硫鍵和蛋白質連接，限制了其相對于蛋白質 的運動，所以測得的PCS和RDC值比L-4大的多。標簽L-5的缺點是其自身的凈電荷，因為 其與鑭系金屬離子配位后顯+3價，在研宄蛋白質-蛋白質或蛋白質-配體識別時這三個額 外的正電荷會造成一些未知的影響。
[0010] Liu 等（7； ▲?? ae?. 5bc.，2012，134: 17306 - 17313.)設計合成了標簽 L-6 (見圖2)，它含有兩個對硝基苯酚基團，對位硝基增強了苯酚的酸性，與鑭系金屬離子配位 后質子會離去，配合物總體顯+1價，和L-5相比，明顯少兩個正電荷。化合物L-6和蛋白質 連接后，也是產生一套PCS。值得注意的是，當標簽L-6與酵母細胞色素C突變體連接以后， 滴加鑭系金屬離子，譜圖中大部分氨基酸殘基出現兩套鋒，而且峰強度和化學位移值隨pH 的不同發生變化。但是標簽L-5連接到同一蛋白質的相同位點只有一套PCS，這是因為L-6 中對硝基苯酚的氧原子電荷密度比L-5中吡啶氮氧化物的氧原子小，這種情況導致了水分 子參與鑭系金屬離子的配位，但這并不是L-6有兩套PCS的根本原因，因為L-6和其它蛋白 質相連時沒有兩套鋒。真正的原因是在酵母細胞色素C突變體中，標簽連接位點附近有一 個組氨酸殘基，組氨酸咪唑環中的氮原子可以與參與配位的水分子形成氫鍵，破壞了絡合 物的對稱性，產生非對映異構體。pH的不同會影響氫鍵的變化，導致兩種非對映異構體相互 轉換，因此可以通過調節PH，用同一個配體得到兩組不同的PCS數據。
[0011] Graham 等（沒ioco/u?收ate cAe?.，2011，22: 2118 - 2125.)在 DOTA 衍生物中引 入了手性酰胺，從而使化合物L-7 (見圖2)和鑭系金屬離子配位后只有一種構象，由于空間 體積比較大，限制了其相對于蛋白質的運動，所以觀測到比較大的PCS。
[0012] Loh 等?收ate ，2013，24: 260 - 268.)通過點擊化學的方法成功 地將D0TA衍生物L-8 (見圖2)定點標記到蛋白質上。具體方法是把非天然氨基酸擴疊氮 基-L-苯丙氨酸（AzF)引入到蛋白質中，Cu (I)作為催化劑，標簽L-8和AzF發生環加成反 應共價連接到蛋白質ubiquitin上。和常用的二硫鍵連接相比，三挫環有更好的剛性和化 學穩定性，但是這個反應需要在無氧條件下進行，增大了實驗的復雜性，而且催化劑Cu (I) 會導致蛋白質樣品沉淀。
【發明內容】
[0013] 本發明的目的是針對上述技術分析和存在的問題，提供一種以1，4, 7, 10-四氮 雜環十二烷為骨架的手性順磁探針，該順磁探針可與蛋白質的特定位點進行選擇性連接， 手性專一、構象單一，譜圖只有一套峰，靈敏度高；高度化學選擇性；電中性，對大分子影響 小；水溶性好、配位點多、穩定性強、齒合度高；剛性極強，對大分子固定作用好；探針與蛋 白質通過穩定的硫醚鍵連接，可以進行細胞內測量。
[0014] 本發明的技術方案： 一種以1，4, 7, 10-四氮雜環十二烷為骨架的手性順磁探針，其化學名稱為 1，4, 7, 10-四氮雜環十二烷-1- (2-甲基-4-苯砜基-6-亞甲基）吡啶-2, 3, 4-三（S)-丙 酸負離子-Tm3+配合物，化學分子式為C 3(lH4(lN508STm，化學結構式為：
【主權項】
1. 一種W 1，4, 7, 10-四氮雜環十二燒為骨架的手性順磁探針，其特征在于：化學名稱 為1，4, 7, 10-四氮雜環十二燒-1-(2-甲基-4-苯諷基-6-亞甲基川比晚-2, 3, 4- S (S)-丙 酸負離子-Tm3+配合物，化學分子式為C scftAOsSTm，化學結構式為：
2. -種如權利要求1所述W 1，4, 7, 10-四氮雜環十二燒為骨架的手性順磁探針的制備 方法，其特征在于步驟如下： 1) 2, 6-二甲基化晚氮氧化物的合成 將2, 6-二甲基化晚、冰己酸、30wt%過氧化氨按體積比為15 ;80 ;25混合，保持80°C加 熱攬拌回流4-1化直至原料轉化完全，將所得混合液減壓濃縮至S分之一后倒入冰水混合 物中，冰水混合物中2, 6-二甲基化晚與冰水混合物的用量比為15. OmL ;100g，然后用碳酸 鐘固體將體系調至抑〉8,依次用二氯甲燒萃取、無水硫酸鋼干燥，過濾后旋干，得到淡黃色 油狀物2, 6-二甲基化晚氮氧化物； 2) 2, 6-二甲基-4-硝基化晚氮氧化物的合成 將上述2, 6