用于氧化還原反應的試劑組合物的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及用于改善用于氧化還原反應的試劑的穩定性的穩定性組合物，并且涉及具有改善的穩定性的用于氧化還原反應的試劑組合物。用于氧化還原反應的試劑組合物可以被應用于電化學生物傳感器的試劑。
【背景技術】
[0002]血糖水平的周期性測量對于管理糖尿病是重要的，并且已經通過使用各種具有精確度和準確度的電化學生物傳感器進行。用于測量血糖水平的電化學傳感器通過以下方法制造:將包括酶、電子轉移劑(electron transfer)和各種穩定劑以及分散劑的試劑施加到工作電極，并干燥施加有試劑的工作電極。影響電化學生物傳感器的特性的最重要的因素是酶和電子轉移劑的性能。
[0003]例如，最商業可得的電化學傳感器使用的作為葡萄糖氧化還原酶的FAD-GOx (黃素腺嘌呤二核苷酸-葡糖氧化酶)具有熱穩定性和對僅氧化葡萄糖的反應特異性，但是，通過使用采用FAD-GOx的傳感器，趨于對血源如靜脈血、動脈血和外周血顯示大的測量值的波動，這是因為酶與溶解在血液中的氧發生反應。
[0004]同時，采用吡咯喹諾酮醌-葡萄糖脫氫酶(PQQ-GDH)的傳感器幾乎不受血氧的影響，但顯示對單糖類如甘露糖、麥芽糖和乳糖或二糖類的特異性。尤其是，已經報道了由于具有腎腹膜透析的患者體中麥芽糖的影響，傳感器可以引起團體醫學實踐(facultymedical practice) ο采用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸_葡萄糖脫氫酶(NAD-GDH)的傳感器比PQQ-GDH顯示更好的反應特異性，這是因為它不與二糖類如甘露糖、麥芽糖和乳糖發生反應，但具有需要NAD+或NADP +作為輔助因子以及低儲存穩定性的缺點。
[0005]最近，使用黃素腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脫氫酶(FAD-GDH)的電化學傳感器已經被廣泛使用，這是因為它不受血氧的量的影響，具有高的穩定性并且不像PQQ-GDH具有對麥芽糖的特異性。然而，根據產生酶的細菌或真菌的種類，FAD-GDH可使用有限種類的電子轉移劑(介體)。
[0006]鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]通常被用作電子轉移劑。其廉價并且由于高反應性可用于采用FAD-GOx、PQQ-GDH、或FAD-GDH的傳感器。然而，使用鐵氰化鉀作為電子轉移劑的傳感器可顯示由血液中的干擾物質如尿酸或龍膽酸引起的測量誤差，并且由于溫度和濕度引起的劣化而必須被特別小心地制造和儲存。此外，因為被儲存長時間之后的接地電流(groundcurrent)的變化，難以精確地檢測低濃度的葡萄糖。
[0007]與鐵氰化物相比，三氯化六銨合釕[Ru (NH3) 6C13]具有更好的氧化還原穩定性。利用三氯化六銨合釕作為電子轉移劑的傳感器可以容易地制造和儲存，并且在長時間的儲存之后接地電流的變化小。然而，三氯化六銨合釕不能與FAD-GDH —起使用，這導致難以制造商業可用的傳感器。
[0008]最近，存在幾種嘗試以通過使用特殊類型的生物傳感器來檢測血糖，該生物傳感器使用具有納米孔表面、而不包括酶和電子轉移劑的電極。例如，US8，083，926提出了通過使用具有環糊精納米孔的電極檢測低濃度的葡萄糖的方法。這種傳感器不適于檢測非常小量的葡萄糖，并且不適于傳感器的大量生產。
[0009]因此，仍然需要用于氧化還原反應的試劑，或更具體地，用于電化學生物傳感器的用于氧化還原反應的試劑，其不受氧的影響，由溫度、濕度和長期儲存引起的性能變化范圍小，檢測寬范圍的葡萄糖濃度，并且適于大量生產。本發明提供了滿足要求的生物傳感器試劑組合物。
【發明內容】
[0010]本發明人確認了通過添加親水性包合化合物(inclus1n compound)至可用于電化學生物傳感器的用于氧化還原反應的試劑，可以穩定氧化還原酶和電子轉移劑，并且完成了本發明。
[0011]因此，本發明的實施方式提供了組合物，其包括含親水性包合化合物，該組合物用于穩定用于氧化還原反應的試劑。
[0012]另一實施方式提供了具有改善的穩定性的用于氧化還原反應的試劑組合物，其包括氧化還原酶、電子轉移介體和親水性包合化合物。
[0013]進一步的實施方式提供了制備具有改善的穩定性的用于氧化還原反應的試劑組合物的方法，其包括混合氧化還原酶、電子轉移介體和親水性包合化合物的步驟。
[0014]進一步的實施方式提供了電化學生物傳感器，其包括可用于電化學生物傳感器的具有改善的穩定性的用于氧化還原反應的試劑組合物。
【附圖說明】
[0015]圖1是根據本發明的實施方式的平面式生物傳感器的分解斜視圖。
[0016]圖2是根據本發明的實施方式的面對面式(夾層式)生物傳感器的分解斜視圖。
[0017]圖3是顯示使用本發明的實施例2中的平面式生物傳感器由各種葡萄糖濃度引起的電流變化的圖。
[0018]圖4是顯示使用本發明的實施例1中的面對面式生物傳感器由各種葡萄糖濃度引起的電流變化的圖。
[0019]圖5是顯示當在50°C下溫育實施例3和對比例2的面對面式生物傳感器并根據本發明實施例3施加各種葡萄糖濃度時斜率變化的圖。
[0020]圖6是本發明的實施方式使用的硫堇的結構。
[0021]圖7是本發明的實施方式使用的硫堇衍生物的結構。
【具體實施方式】
[0022]本發明人發現了，當硫堇或1-甲氧基PMS(1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽)和三氯化六銨合釕組合作為用于FAD-GDH酶的電子轉移介體使用時，酶和電子轉移介體之間的增加的反應速率顯著改善了對葡萄糖的檢測性能，并且提交了用于生物傳感器的試劑組合物的專利申請(韓國專利申請號2012-0009668)。
[0023]如之前申請中所述，硫堇(圖6)和具有相似結構的硫堇衍生物(圖7)被一起用作第二電子轉移介體以便增加含金屬的絡合物如三氯化六銨合釕(作為第一電子轉移介體)和具有低反應性的氧化還原酶的反應速率，因此引起了不穩定的問題。本發明人持續研宄以解決不穩定的問題，并發現當親水性包合化合物(inclus1n compound)如輕丙基一 α _環糊精(HP- α -⑶)、輕丙基-β-環糊精(HP- β -⑶)或輕丙基_y_環糊精(HP- γ -CD)被添加至試劑組合物作為試劑穩定劑傳感器時，氧氧化還原反應效率和葡萄糖檢測的性能改變幾乎檢測不到。親水性包合化合物可與硫堇形成包合絡合物，從而增加硫堇的溶解度，并且可限制與酶的直接反應，從而增加試劑組合物的穩定性。例如，HP-β-CD具有非常高的水溶性，使得其可以被溶解在水中至50% (w/v)每單位體積。ΗΡ-β-CD可與難溶性材料形成絡合物，得到溶解在水中的穩定絡合物。
[0024]本發明人發現了，在電化學生物傳感器(包括FAD-GDH、轉移介體的三氯化六氨合釕和硫堇)中含有親水性包合化合物，可被用作用于氧化還原反應的試劑，其滿足不與氧反應的性能，由溫度和濕度引起的性能改變非常小，不影響由干擾物質引起的檢測靈敏度，以及良好的長期穩定性，并且親水性包合化合物可被用作用于電化學生物傳感器的試劑和使用其的生物傳感器，從而完成了本發明。
[0025]根據本發明，用于氧化還原反應的試劑或更具體地可用于電化學生物傳感器的用于氧化還原反應的試劑不受氧的影響，由溫度、濕度和長期儲存引起的性能變化范圍小，檢測寬范圍的葡萄糖濃度(例如，5至1000mg/dL)，并且適于大量生產。
[0026]在另一實施方式中，試劑組合物被應用于葡萄糖-檢測生物傳感器作為實例，但可以應用于各種生物傳感器，通過改變使用的酶檢測不同種類的物質如膽固醇、乳酸鹽、肌酸、氫過氧化物、乙醇、氨基酸和谷氨酸鹽。
[0027]根據本發明，用于生物傳感器的試劑的穩定劑和包括該穩定劑的試劑組合物不受氧和干擾物質的影響，由溫度、濕度和長期儲存引起的性能變化范圍小，因此可用作電化學生物傳感器，檢測血液中的各種代謝物，特別是葡萄糖。
[0028]如上所述，本發明的實施方式提供用于穩定用于氧化還原反應的試劑的組合物，該組合物包括親水性包合化合物。
[0029]本發明的實施方式提供用于生物傳感器的試劑，包括親水性包合化合物，因為用于氧化還原反應的試劑可用于電化學生物傳感器的試劑。
[0030]本發明的實施方式提供具有增加的穩定性的用于氧化還原反應的試劑組合物，包括氧化還原酶、電子轉移介體和親水性包合化合物。
[0031]本發明的實施方式提供用于生物傳感器的試劑，包括氧化還原酶、電子轉移介體和親水性包合化合物，因為用于氧化還原反應的試劑可用于電化學生物傳感器的試劑。
[0032]本發明的實施方式提供制備用于氧化還原反應的試劑的方法，包括混合氧化還原酶、電子轉移介體和親水性包合化合物的步驟。
[0033]本發明的實施方式提供制備可用于電化學生物傳感器的用于氧化還原反應的試劑的方法，包括混合氧化還原酶、電子轉移介體和親水性包合化合物的步驟，因為用于氧化還原反應的試劑可用于電化學生物傳感器的試劑。
[0034]本發明的實施方式提供電化學生物傳感器，包括具有增加的穩定性的用于電化學生物傳感器的試劑組合物。
[0035]下文中將更詳細地解釋本發明。
[0036]在本文中，“包合化合物”是指籠形化合物(clathrate compound)或圍欄化合物(enclosure compound)，并且意指這樣的絡合物:其中一個化合物形成格柵腔體，另一個化合物在合適條件下配合在該格柵腔體中。
[0037]親水性包合化合物可為選自由環糊精及其衍生物組成的組的至少一種化合物，更優選環糊精。環糊精可減少葡萄糖檢測能