治療kras相關(guān)疾病的有機組合物的制作方法
【專利說明】治療KRAS相關(guān)疾病的有機組合物
[0001] 發(fā)明背景
[0002] KRAS是小分子GTP酶的RAS亞族中的一員。它參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞的生長、 分化、存活以及其它細胞功能。KRAS以及RAS家族成員HRAS和NRAS的過度表達或活性 過高與包括各種癌癥在內(nèi)的多種疾病有關(guān)。在約三分之一的全部人類惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了 RAS突變（Bos等人，1989. Cancer Res. 49:4682-4689)。KRAS占了大多數(shù)人類惡性腫瘤中 所發(fā)現(xiàn)的RAS突變的大部分，包括在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)的RAS突變的90% (Forbes等人，2006. Br. J. Cancer 94:318-322)〇
[0003] KRAS的突變、活性過高和/或過度表達與癌癥有關(guān)，包括腺癌、結(jié)腸直腸癌（包括 晚期和轉(zhuǎn)移的結(jié)腸直腸癌）、結(jié)腸癌、肺癌（包括非小細胞肺癌和肺腺癌）、急性髓細胞性 肺癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、白血病、骨髓增生異常 綜合癥、髓系白血病、肝癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、睪丸癌、甲狀腺癌、心面皮膚 (CFC)綜合征和努南綜合征，以及類似和相關(guān)的疾病。
[0004] 需要與KRAS相關(guān)疾病相關(guān)的治療。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 本公開涵蓋針對KRAS的RNAi (RNA干擾）劑，其可用于治療KRAS相關(guān)疾病，例如 癌癥、心面皮膚（CFC)綜合征和努南綜合征，以及類似和相關(guān)的疾病。
[0007] 本公開還涵蓋一種治療患有至少部分由KRAS表達介導(dǎo)的病理狀態(tài)的人類個體的 方法，所述方法包括向所述個體施用治療有效量的針對KRAS的RNAi劑的步驟。
[0008] 該方法還任選地進一步包括施用第二種活性劑的步驟。在一些實施方案中，所述 第二種活性劑是針對KRAS的另一種RNAi劑。在另一些實施方案中，第二種活性劑是另一 種治療，例如針對另一種也在病理狀態(tài)中活性過高、突變和/或過度表達的靶點的治療。
[0009] 本公開提供可用于減少個體（例如哺乳動物，如人）中KRAS水平的特異性RNAi 劑和方法。本公開特別地提供包含KRAS的至少15個到至少19個或更多個連續(xù)核苷酸的 雙鏈RNAi劑。具體而言，本公開提供包含與例如表1至6中提供的RNAi劑的那些序列差 異0、1、2或3個核苷酸的15個或更多個連續(xù)核苷酸的序列的活性劑。在一個實施方案中， RNAi劑特別可以包含每條鏈小于30個核苷酸，例如，17至23個核苷酸，15至19個核苷酸， 18至22個核苷酸，和/或19至21個核苷酸，和/或如例如在表1至6中提供的那些，及其 修飾變體和未修飾變體（例如其中的有義鏈和/或反義鏈或第一鏈和/或第二鏈是修飾的 或未修飾的）。本公開還提供包含有義鏈和反義鏈的活性劑，其中所述有義鏈和/或反義 鏈包含與例如表1至6中提供的RNAi劑及其修飾變體和未修飾變體的那些序列差異0、1、 2或3個核苷酸的19個或更多個連續(xù)核苷酸的序列。有義鏈和反義鏈可以是連續(xù)的，或共 價結(jié)合，例如，借助環(huán)或接頭共價結(jié)合。在一個實施方案中，RNAi劑特別可以包含每條鏈小 于30個核苷酸，例如，17至23個核苷酸，18至22個核苷酸和/或19至21個核苷酸，和/ 或如例如在表1至6中提供的序列。
[0010] 雙鏈RNAi劑可以具有0、1或2個平末端，和/或從一個末端或3'末端和/或5' 末端具有含1、2、3個或4個核苷酸（即，1至4個核苷酸）的突出端。雙鏈RNAi劑也可以 任選地包含一個或兩個3'帽結(jié)構(gòu)和/或一個或多個修飾的核苷酸。本文所提供的序列的 修飾變體包括那些除了天然核苷酸被相應(yīng)的修飾的核苷酸置換外其它均相同的變體。
[0011] 此外，RNAi劑可以僅包含天然的核苷酸亞單位（例如核糖核苷酸），或包含針對一 個或多個替換核苷酸亞單位的糖、磷酸酯或堿基的一個或多個修飾，無論它們是否包含核 糖核苷酸亞單位或脫氧核糖核苷酸亞單位或其它相關(guān)的修飾變體。在一個實施方案中，公 開的RNAi劑的修飾變體具有替換尿苷的胸苷（作為RNA，或優(yōu)選地，DNA)，或具有肌苷堿基。 在一些實施方案中，公開的RNAi劑的修飾變體可以具有位于過客鏈中的切口、引導(dǎo)鏈與過 客鏈之間的錯配、替代引導(dǎo)鏈和過客鏈的一部分（例如種子區(qū)）中的RNA的DNA、和/或縮 短的過客鏈（例如15、16、17或18個核苷酸）。一旦確定了功能性引導(dǎo)鏈，就可以容易地制 備RNAi劑的修飾和變體。任何不相互排斥的修飾的組合均是可行的（例如堿基修飾與縮 短的過客鏈的組合；有切口的過客鏈與堿基修飾的組合；或DNA替代部分或全部種子區(qū)與 剩余RNA的堿基修飾的組合等）。
[0012] 在一個實施方案中，公開的RNAi劑的修飾變體包括具有與表1至6中所公開的序 列相同的序列（例如，相同堿基序列）、但是具有針對一個或多個核苷酸亞基的糖或磷酸酯 中一者或多者的一個或多個修飾的RNAi劑。在一個實施方案中，所述修飾改善RNAi劑的 功效、穩(wěn)定性（例如，針對血清和/或腸液中的核酸酶）和/或降低免疫原性。本公開的一 個方面涉及包含至少一個非天然核堿基的雙鏈寡核苷酸。在某些實施方案中，非天然核堿 基是二氟甲苯基、硝基吲哚基、硝基吡咯基或硝基咪唑基。在一個特定實施方案中，非天然 核堿基是二氟甲苯基。在某些實施方案中，兩條寡核苷酸鏈中僅一條鏈含有非天然核堿基。 在某些實施方案中，兩條寡核苷酸鏈均含有非天然核堿基。
[0013] RNAi劑可以任選地連接至被選擇用來改善RNAi劑的一種或多種特征，例如，穩(wěn)定 性、分布和/或細胞攝入的配體，例如膽固醇或其衍生物。RNAi劑可以是分離的或是用于本 文所述方法的藥物組合物的一部分。特別地，藥物組合物可以被配制成用于向特定的組織 (例如，KRAS-相關(guān)疾病的患病組織）遞送或配制成用于胃腸外給藥。藥物組合物可以任選 地包含兩種或更多種RNAi劑，每一種涉及KRAS mRNA的相同或不同區(qū)段。任選地，藥物組 合物還可以包含用于任何KRAS相關(guān)疾病的任何已知治療或與其聯(lián)合使用。
[0014] 本公開還提供了用于降低細胞中KRAS mRNA水平的方法，特別是在以KRAS過度表 達或活性過高為特征的疾病情況下。包含KRAS的改變例如突變、過度表達和/或活性過高 的細胞被稱為"KRAS缺陷型"細胞。所述方法包括向細胞施用一種或多種本公開的RNAi劑 的步驟，如下文進一步所述。本發(fā)明的方法利用參與RNA干擾的細胞機制來選擇性地降解 細胞中的靶RNA，并且包括使細胞與本公開的一種或多種RNAi劑接觸的步驟。
[0015] 本公開還提供了用于降低細胞中KRAS mRNA水平的方法，特別是在以KRAS過度表 達、突變或活性過高為特征的疾病情況下。所述方法包括向細胞施用一種或多種本公開的 RNAi劑的步驟，如下文進一步所述。本發(fā)明的方法利用參與RNA干擾的細胞機制來選擇性 地降解細胞中的靶RNA，并且包括使細胞與本公開的一種或多種RNAi劑接觸的步驟。
[0016] 本公開還涵蓋一種治療患有至少部分由KRAS表達介導(dǎo)的病理狀態(tài)的人類個體的 方法，所述方法包括向所述個體施用治療有效量的靶向KRAS的RNAi劑的步驟。額外的方法 涉及預(yù)防、治療、調(diào)節(jié)和/或改善其中疾病的進展（例如，腫瘤生長）需要KRAS (雖然KRAS 未擴增、過度表達或錯誤定位）的病理狀態(tài)。所述方法包括向個體施用一種或多種本公開 的RNAi劑的步驟，如下文進一步所述。本發(fā)明的方法利用參與RNA干擾的細胞機制來選擇 性地降解細胞中的靶RNA，并且包括使細胞與本公開的一種或多種RNAi劑接觸的步驟。所 述方法可以對細胞直接進行，或者可以通過向個體施用本公開的一種或多種RNAi劑/藥物 組合物而對哺乳動物個體進行。減少細胞中的靶KRAS RNA導(dǎo)致所產(chǎn)生的編碼的KRAS蛋白 的量減少。在生物體中，這可以導(dǎo)致恢復(fù)涉及KRAS的途徑中的平衡、和/或阻止KRAS積累、 和/或降低KRAS活性和/或表達、和/或阻止KRAS介導(dǎo)的其它基因激活、和/或改善、治 療和/或預(yù)防KRAS相關(guān)疾病。在一個實施方案中，KRAS表達、水平或活性的降低可以限制 腫瘤生長。
[0017] 本公開的方法和組合物，例如，該方法和KRAS RNAi劑組合物，可以以本文所述的 或本領(lǐng)域已知的任何適宜劑量和/或制劑、以本文所述的或本領(lǐng)域已知的任何適宜的施用 途徑使用。
[0018] 在附圖和下文描述中闡述本公開的一個或多個實施方案的詳細內(nèi)容。多種實施方 案的不相互排斥的要素（例如，RNAi劑的序列、修飾、末端帽結(jié)構(gòu)、組合、涉及KRAS RNAi劑 和另一種活性劑的組合療法等）可以彼此組合，其如本文所述并且是本領(lǐng)域已知的或被開 發(fā)的。例如，本文中公開的任何RNAi劑序列可以與本文中公開的任何修飾或末端帽結(jié)構(gòu)的 集合相組合。修飾、5'末端帽結(jié)構(gòu)和/或3'末端帽結(jié)構(gòu)的任何組合可以隨本文中公開的任 何RNAi劑序列一起使用。本文中公開的任何RNAi劑（具有修飾或末端帽結(jié)構(gòu)的任何組合 或者不具有修飾或末端帽結(jié)構(gòu)）可以與本文中公開的任何其它RNAi劑或其它治療組合物 或方法組合。
[0019] 從本說明書、附圖和權(quán)利要求書中可以明顯看出本公開的其它特征、目的和優(yōu)點。
[0020] 附圖簡述
[0021] 圖1顯示各種修飾的核苷酸：可以在本文中公開的RNAi劑中使用的U002、U003、 U004、U005、C004、C005、A004、A005、G005 和 G004。U002 表示作為 DNA 的 2' -脫氧胸苷。 U003表示2' -脫氧尿苷。U004表示具有帶2' -O-甲基修飾的尿苷（"U"）堿基的核苷酸。 U005表示帶2' -O-甲氧基乙基（MOE)修飾的U堿基。C004表示帶2' -O-甲基修飾的半胱 氨酸（"C"）堿基。C005表示帶2' -0-甲氧基乙基修飾的C堿基。A004表示帶2' -0-甲 基修飾的腺苷（"A"）堿基。A005表示帶2' -0-甲氧基乙基修飾的A堿基。G005表示帶 2' 0-甲基修飾的鳥苷（"G"）堿基。G004表示帶2' 0-甲基修飾的G堿基。
[0022] 發(fā)明詳述
[0023] 本公開涵蓋用于靶向和抑制KRAS基因的針對KRAS的RNAi劑，所述RNAi劑