通過抑制腦源神經營養因子(bdnf)的天然反義轉錄物治療bdnf相關疾病的制作方法
【專利說明】通過抑制腦源神經營養因子（BDNF)的天然反義轉錄物治 療BDNF相關疾病
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年3月15日提交的美國臨時專利申請系列號61/611，225和2012 年3月23日提交的美國臨時專利申請系列號61/614, 664的利益，這兩者全文通過引用并 入本文。 發明領域
[0003] 本發明的實施方案包括調節BDNF和相關分子的表達和/或功能的寡核苷酸。
【背景技術】
[0004] DNA-RNA和RNA-RNA雜交對于核酸功能的許多方面（包括DNA復制、轉錄和翻譯） 而言為重要的。雜交對于探測特定核酸或者改變其表達的各種技術而言亦為主要的。反義 核苷酸例如通過與靶RNA雜交來擾亂基因表達，從而干擾RNA剪接、轉錄、翻譯和復制。反 義DNA具有DNA-RNA雜合體充當核糖核酸酶H消化的底物的附加特征，該核糖核酸酶H消 化活性存在于大多數細胞類型中。可將反義分子遞送到細胞中，這與寡脫氧核苷酸（ODN) 的情況一樣，或者它們可作為RNA分子由內源基因表達。FDA最近批準了一種反義藥物， VITRAVENE?(用于治療巨細胞病毒視網膜炎），這反映了反義物具有治療應用。
[0005] WO 2010/093904及其美國對應申請US/2011/0319475公開了 BDNF作為使用本文 所述的寡核苷酸調節的靶標。存在著針對天然反義靶標進行持續開發和與這種靶標互補并 調節BDNF蛋白表達以潛在地治療BDNF相關疾病和病癥或用于與治療BDNF相關疾病和病 癥有關的研宄中的新開發寡核苷酸的需要。
[0006] 發明概述
[0007] 提供本概述以呈現本發明的概要，從而簡要地指出本發明的性質和實質。在理解 以下的情況下提出本概述：其不會用于解釋或限制權利要求的范圍或含義。
[0008] 在一個實施方案中，本發明提供通過使用靶向于天然反義轉錄物的任何區域的反 義寡核苷酸來抑制天然反義轉錄物的作用，從而引起哺乳動物生物體中相應BDNF有義基 因的上調的方法。本文也考慮本文所述的天然反義轉錄物的抑制可通過siRNA、核酶和小分 子來實現，其認為在本發明的范圍之內。
[0009] -個實施方案提供在體內或體外調節生物系統（包括，但不限于患者細胞或組 織）中的BDNF多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括用長度為約5-約30個核 苷酸的反義寡核苷酸接觸所述生物系統或所述細胞或組織，其中所述寡核苷酸與以下多核 苷酸的反向互補序列具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO :3的核 苷酸 1-1279 或 SEQ ID NO:4 的核苷酸 1-1478 或 SEQ ID NO:5 的核苷酸 1-1437 或 SEQ ID NO:6的核苷酸1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364 或 SEQ ID N0:9 的核苷酸 1-3136 或 SEQ ID NO: 10 的核苷酸 1-906 或 SEQ ID NO: 11 的核 苷酸1-992之內的5-30個連續核苷酸，從而在體內或體外調節所述生物系統包括所述患者 細胞或組織中BDNF多核苷酸的功能和/或表達，條件是排除具有SEQ ID NO: 50-55的寡核 苷酸。
[0010] 在一個實施方案中，上述的寡核苷酸靶向于生物系統中存在的BDNF多核苷酸的 天然反義序列，例如SEQ ID NO :3-11所示的核苷酸，以及其任何變體、等位基因、同源物、突 變體、衍生物、片段和互補序列。這類反義寡核苷酸的實例如SEQ ID NO :12-49所示。
[0011] 在另一個實施方案中，本發明包括調節生物系統中BDNF多核苷酸的功能或表達 的方法，包括用靶向于BDNF多核苷酸的天然反義轉錄物的至少一個反義寡核苷酸接觸所 述生物系統，所述天然反義轉錄物包含在SEQ ID NO :3的核苷酸1-1279或SEQ ID NO: 4的 核苷酸1-1478或SEQ ID NO: 5的核苷酸1-1437或SEQ ID NO: 6的核苷酸1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364或SEQ ID NO:9的核苷酸1-3136 或SEQ ID NO: 10的核苷酸1-906或SEQ ID NO: 11的核苷酸1-992之內的5-30個連續核 苷酸，從而調節所述生物系統中BDNF多核苷酸的功能和/或表達。
[0012] 在另一個實施方案中，本發明包括調節生物系統中BDNF多核苷酸的功能或表達 的方法，包括用靶向于BDNF多核苷酸的天然反義轉錄物的區域的至少一種反義寡核苷酸 接觸所述生物系統，所述天然反義轉錄物包含在SEQ ID NO :3的核苷酸1-1279或SEQ ID N0:4的核苷酸1-1478或SEQ ID N0:5的核苷酸1-1437或SEQ ID N0:6的核苷酸1-2322 或SEQ ID NO: 7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364或SEQ ID NO:9的核苷 酸1-3136或SEQ ID NO: 10的核苷酸1-906或SEQ ID NO: 11的核苷酸1-992之內的5-30 個連續核苷酸，從而調節所述生物系統中BDNF多核苷酸的功能和/或表達。
[0013] 在一個實施方案中，本發明包括提高生物系統中具有SEQ ID N0:1和2的BDNF多 核苷酸的功能和/或表達的方法，包括用靶向于所述BDNF多核苷酸的天然反義轉錄物的 至少一種反義寡核苷酸接觸所述生物系統，所述天然反義轉錄物包含在SEQ ID NO :3的核 苷酸 1-1279 或 SEQ ID NO:4 的核苷酸 1-1478 或 SEQ ID NO:5 的核苷酸 1-1437 或 SEQ ID NO:6的核苷酸1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364 或 SEQ ID N0:9 的核苷酸 1-3136 或 SEQ ID NO: 10 的核苷酸 1-906 或 SEQ ID NO: 11 的核 苷酸1-992之內的5-30個連續核苷酸，從而提高所述BDNF多核苷酸或其表達產物的功能 和/或表達。
[0014] 在另一個實施方案中，本發明包括提高生物系統中具有SEQ ID N0:1和2的BDNF 多核苷酸的功能和/或表達的方法，包括用靶向于所述BDNF多核苷酸的天然反義轉錄物的 至少一種反義寡核苷酸接觸所述生物系統，從而提高所述BDNF多核苷酸或其表達產物的 功能和/或表達，其中所述天然反義轉錄物選自SEQ ID N0:3-ll。
[0015] 在另一個實施方案中，本發明包括提高生物系統中具有SEQ ID N0:1和2的BDNF 多核苷酸的功能和/或表達的方法，包括用靶向于所述BDNF多核苷酸的天然反義轉錄物的 至少一種反義寡核苷酸接觸所述生物系統，從而提高所述BDNF多核苷酸或其表達產物的 功能和/或表達，其中所述天然反義轉錄物選自SEQ ID N0:3-ll和其中所述反義寡核苷酸 選自SEQ ID NO: 12-49的至少一種。
[0016] 在一個實施方案中，組合物包含一種或多種與有義和/或反義BDNF多核苷酸結合 的反義寡核苷酸。
[0017] 在一個實施方案中，所述寡核苷酸包含一個或多個經修飾或取代的核苷酸。
[0018] 在一個實施方案中，所述寡核苷酸包含一個或多個經修飾的鍵。
[0019] 在又另一個實施方案中，所述修飾的核苷酸包含經修飾的堿基，其包括硫代磷酸 酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2'-0-甲基、氟或碳、亞甲基或其他鎖核酸（LNA)分子。優選地，所 述修飾的核苷酸為鎖核酸分子，包括a -L-LNA。
[0020] 在一個實施方案中，將所述寡核苷酸經皮下、肌內、靜脈內或腹膜內施用于患者。
[0021] 在一個實施方案中，將所述寡核苷酸在藥物組合物中施用。治療方案包括至少一 次向患者施用反義化合物；然而，可將此治療修改成在一段時間內包含多個劑量。所述治療 可與一種或多種其它類型的療法組合。
[0022] 在一個實施方案中，將所述寡核苷酸封裝到脂質體中或連接于載體分子（例如膽 固醇、TAT肽）。
[0023] 在一個實施方案中，本發明包括SEQ ID Ν0:50-55作為靶向于天然反義轉錄物 (NAT)的寡核苷酸調節BDNF多核苷酸的表達的用途，其中所述NAT選自SEQ ID ΝΟ:3-11。 在另一個實施方案中，本發明包括SEQ ID Ν0:50-55作為靶向于天然反義轉錄物（NAT)的 寡核苷酸調節BDNF多核苷酸的表達的用途，其中所述NAT選自SEQ ID N0:3、4、5、7、8、9、10 和11〇
[0024] 其它方面描述于下文。
[0025] 附圖簡要說明
[0026] 圖la_e顯示有義mRNA和蛋白質的反義介導的調節。圖Ia顯示，在用革E向于 BDNF-AS轉錄物的非重疊區域的三種siRNA寡核苷酸轉染幾種人和小鼠細胞系后，發生 BDNF轉錄物的敲減和上調。圖Ib顯示BDNF-AS靶向的siRNA施用后BDNF和BDNF-AS轉錄 物的內源表達的時程研宄數據。數據顯示隨著時間過去，BDNF-AS下調，且然后BDNF表達 上調且是可逆的。圖Ic顯示兩種靶向于BDNF-AS轉錄物的siRNA顯著增加通過ELISA測 量的BDNF蛋白，而亂序的siRNA或對照的非靶向siRNA不顯著增加 BDNF蛋白。圖Id顯示 施用各種siRNA后使用ELISA和/或蛋白質印跡測量的BDNF的蛋白質水平。圖Ie顯示相 對于提高的寡核苷酸濃度（1〇_ 12-1〇_6Μ)與模擬對照相比的百分倍數變化。
[0027] 圖2顯示Bdnf上調提高神經元突起生長（neuronal outgrowth) 〇
[0028] 圖3顯不Bdnf-AS在體內調節Bdnf mRNA和蛋白質。
[0029] 圖4顯示體內Bdnf-AS的阻斷引起神經元存活和增殖的增加。
[0030] 圖5顯示BDNF-AS敲減導致BDNF mRNA上調。
[0031] 圖6顯示Bdnf表達的轉錄后調節。
[0032] 圖 7 顯示 hBDNFAntagoNAT 抑制人 BDNF-AS 轉錄物。
[0033] 圖8顯示AntagoNAT抑制N2a細胞中的小鼠 Bdnf-AS轉錄物。
[0034] 圖9顯示BDNF-AS敲減既不改變TrkB的水平也不改變兩個方向的BDNF相鄰基因 (Let7C和KIF18A) :LIN7C和KIF18A分別是位于BDNF3'下游和5'上游的基因。
[0035] 序列表的說明：SEQ ID NO: 1 :人腦源神經營養因子（BDNF)，轉錄物變體3, mRNA. (NCBI登錄號：NM_170735);SEQ ID N0:2:小鼠腦源神經營養因子（Bdnf)，轉錄物變體1， mRNA(NCBI登錄號：NM_007540) ;SEQ ID N0:3:天然BDNF反義序列（轉錄物變體BTlA; NR_033313. I) ;SEQ ID N0:4:天然 BDNF 反義序列（轉錄物變體 BT2A;NR_033314. I) ;SEQ ID N0:5:天然 BDNF 反義序列（轉錄物變體 BT1B;NR_033315.1) ;SEQ ID N0:6:天然 BDNF 反義序列（轉錄物變體BT2B;NR_002832.2) ;SEQ ID N0:7:天然BDNF反義序列（轉錄物變 體 BTlC ;NR_033312. I) ;SEQ ID N0:8 :天然 BDNF 反義序列（BDNF-AS 變體）；SEQ ID N0:9 : 天然BDNF反義序列；SEQ ID NO: 10 :小鼠天然BDNF反義序列（小鼠 BDNF-AS變體I) ;SEQ ID NO: 11:小鼠天然BDNF反義序列（小鼠 BDNF-AS變體2) ;SEQ ID NO: 12-55:反義寡核 苷酸；SEQ ID NO:56-59 :分別反義寡核苷酸12-15的反向互補序列；SEQ ID NO:60-64 :分 別反義寡核苷酸42-46的反向互補序列；SEQ ID NO:65和66 :分析序列。LNA(2' -0, 4' -C 亞甲基鎖核酸）：+A*或+T*或+O或+G* ;2' 0M(2' -0-甲基）：mU*或mA*或mO或mG* ; PS (硫代磷酸醋）：T*或A*或G*或c* ;RNA :rU或rA或rG或rC。
[0036] 詳細說明
[0037] 參考用于說明的示例應用在下文中描述本發明的數個方面。應當理解的是，陳述 許多具體細節、關系和方法來提供對本發明的充分理解。然而，在相關領域的普通技術人員 將容易地認識到，可在不含一個或多個具體細節的情況下實施本發明或者可用其他方法來 實施本發明。本發明不受行為或事件的排序限制，因為一些行為可以不同的順序進行和/ 或與其他行為或事件同時進行。此外，并非所有說明性的行為或事件對實施本發明的方法 都為必需的。
[0038] 本文公開的所有基因、基因名稱和基因產物意圖對應來自任何物種的同源物，對 該物種而言本文公開的組合物和方法為適用的。因此，該術語包括但不限于來自人和小鼠 的基因和基因產物。應當理解的是，當公開來自具體物種的基因或基因產物時，意圖此公開 僅為示范性的，并且除非其出現的上下文中明確指示，否則不應理解為限制。因此，例如，對 于本文公開的在一些實施方案中有關哺乳動物核酸和氨基酸序列的基因而言，意圖包括來 自其他動物（包括，但不限于其他哺乳動物、魚類、兩棲動物、爬行動物和鳥類）的同源和/ 或直向同源基因和基因產物。在一個實施方案中，所述基因或核酸序列為人的基因或核酸 序列。定義
[0039] 本文所用的術語僅以描述具體的實施方案為目的而不意圖限制本發明。除非上下 文另有明確指示，否則本文所用的單數形式"一"、"一個"和"所述"也意圖包括復數形式。 此外，就術語"包括的"、"包括"、"具有的"、"具有"、"含有"或其變型在詳述和/或權利要求 中所用的程度而言，這類術語意圖以類似于術語"包含"的方式是包涵性的。
[0040] 術語"約"或"大約"意為在由本領域普通技術人員所確定的具體值的可接受誤差 范圍之內，這部分取決于該值是如何測定或確定的，即，測量系統的限制。例如，按照本領域 的實踐，"約"可意為在1或大于1的標準偏差之內。或者，"約"可意為給定值的最多20%， 優選10%，更優選5%，和還更優選1 %的范圍。或者，具體地關于生物系統或過程，該術語 可意為在值的一個數量級之內，優選在值的5倍之內，更優選在2倍之內。當本申請和權利 要求描述具體值時，除非另作說明，否則應假設術語"約"意為在具體值的可接受誤差范圍 之內。
[0041] 本文所用的術語"mRNA"意為目前已知的靶向于基因的mRNA轉錄物，以及任何可 闡明的其它轉錄物。
[0042] "反義寡核苷酸"或"反義化合物"意為與另一個RNA或DNA (靶RNA、DNA)結合的 RNA或DNA分子。例如，如果其為RNA寡核苷酸，則其通過RNA-RNA相互作用結合另一個RNA 靶標并改變靶RNA的活性。反義寡核苷酸可上調或下調特定多核苷酸的表達和/或功能。 該定義意在包括從治療、診斷或其他觀點來看有用的任何外源RNA或DNA分子。這類分子 包括例如反義RNA或DNA分子、干擾RNA(RNAi)、微RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶促RNA、治 療性編輯RNA(therapeutic editing RNA)以及激動劑和詰抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義 寡核苷酸、外