擴增子文庫的構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及高通量測序領域，具體而言，涉及一種擴增子文庫的構建方法。
【背景技術】
[0002] 生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學的研宄有著十分重要的意義。第一代 測序儀對電泳分離技術的依賴，使其難以進一步提高分析的速度和并行化程度，也難以 通過微型化降低測序成本。經過不斷的技術開發和改進，21世紀初，以Roche 454技術、 illumina公司的Genome Analyzer技術和ABI公司的Solid技術為標記的第二代測序技 術誕生了。第二代技術大大降低了測序成本，還大幅度提高了測序速度并保持了高準確 性。其中，illumina公司的第一臺測序儀于2006年問世，之后開發出來一系列的測序儀，如 Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、Hiseq X等，在準確性、通量、成本和速度方面表現更優秀，而 使其成為全球使用量最大的第二代測序儀。在第二代測序平臺不斷完善的同時，以對單分 子DNA進行非PCR測序為主要特征的第三代測序技術也初顯端倪。但由于其關鍵技術問題 尚待解決，目前還未得到廣泛應用。
[0003] 環境中微生物的群落結構和多樣性是微生物生態學的研宄熱點。微生物多樣性的 研宄涉及農業、土壤、林業、海洋、礦井、人體醫學等諸多領域。傳統研宄手段存在實驗操作 費時費力、不可培養性、無法檢測痕量微生物、無法探索未知等的局限性。第二代高通量測 序技術，尤其是illumina Miseq高通量測序技術的成熟和普及，使我們能夠對環境微生物 進行深度測序，靈敏地檢測環境樣品在細菌、真菌、古菌分類方面物種之間的差異，精確指 導不同環境微生物的構成。
[0004] 16S rDNA是編碼細菌核糖體小亞基的DNA序列，分子大小約1540bp，由9個可變 區和10個保守區交叉排列組成。保守區能反映物種間親緣關系，可變區在不同菌種間存在 差異。根據保守區序列設計引物，將可變區擴增出來進行測序，通過測序數據與相應數據庫 的比對，即可確定微生物在進化樹中的位置，從而鑒定樣本中可能存在的細菌種類。研宄表 明，V4靶基因區域（約300bp)對微生物進行分類較為準確。
[0005] ITSl是位于真核生物的18S rRNA和5. 8S rRNA之間的內轉錄區域，ITS2位于真核 生物的5. 8S rRNA和28S rRNA之間的內轉錄區域。由于進化相對于18S rRNA、5. 8S rRNA 和28SrRNA迅速而具多態性，因而適合于等級水平較低的系統學研宄。根據保守區序列設 計引物，將其擴增出來進行測序，通過測序數據與相應數據庫的比對，即可確定微生物在進 化樹中的位置，從而鑒定樣本中可能存在的真菌種類，是目前非常常見的分析真菌方法。
[0006] 擴增子測序是對特定長度的PCR產物或者捕獲的片段進行測序，不僅包括16S rDNA測序，還包括18S rDNA測序、ITS測序及功能基因檢測等。采用illumina MiSeq第二 代高通量測序平臺對來源于不同環境的樣本進行16S/18S/ITS中某個高變區域深度測序， 能靈敏地探測出環境微生物群落結構隨外界環境的變化而發生的極其微弱的變化，對于我 們研宄微生物與環境的關系，環境治理和微生物資源的利用有著重要的理論和現實意義。
[0007] 為進行微生物擴增子區域的測序，首先需要對目標樣本進行PCR擴增，然后構建 適用于二代測序平臺的文庫。目前的擴增體系主要有20ul和50ul兩種，體系中模板量的 添加一般為經驗值，并沒有一個確定的量，波動性較大，對擴增結果也影響較大。同時退火 溫度則根據引物的不同而不同，一般在50-60°C之間。利用現有擴增技術對上述擴增子進 行擴增，合格率低且非特異性條帶較多。對于難擴增的ITSl和ITS2區域擴增一般使用的 Touchdown技術（65-50 °C )，對PCR儀要求較高。
[0008] 因此，仍需要對現有的針對微生物擴增子的擴增方法進行改進，以降低擴增子文 庫中非擴增子的含量，提高擴增子文庫的合格率，降低文庫構建成本。
【發明內容】
[0009] 本發明提供了一種微生物擴增子文庫的構建方法，以降低擴增子文庫中非擴增子 的含量，提高擴增子文庫的合格率，降低文庫構建成本。
[0010] 為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種微生物擴增子文庫的構 建方法，該構建方法包括以下步驟：S1，對目的片段進行擴增，得到富集的目的片段；以及 S2,對富集的目的片段進行片段化文庫構建，得到擴增子文庫；其中，步驟Sl包括以下步 驟：S11，對目的片段的擴增模板進行定量；S12,對目的片段的擴增引物的退火溫度進行固 定；以及S13,利用擴增引物在退火溫度下對目的片段進行擴增，得到富集目的片段。
[0011] 進一步地，目的片段為16SV4、ITSl或ITS2。
[0012] 進一步地，當目的片段為16SV4時，擴增引物為SEQ ID NO: 1所示的正向引物： GTGCCAGCMGMWGCGGTAA ;以及 SEQ ID N0:2 所示的反向引物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。
[0013] 進一步地，擴增引物的退火溫度為48?52°C，優選為50°C。
[0014] 進一步地，當目的片段為16SV4時，擴增模板為10-20ng。
[0015] 進一步地，當目的片段為ITSl時，擴增引物為SEQ ID N0:3所示的正向引物： GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG ;以及 SEQ ID 勵:4所示的反向引物：6(^6061'1'(：1'1^六1^6六了6(：。
[0016] 進一步地，擴增引物的退火溫度為55?56°C，優選為55. 3°C。
[0017] 進一步地，當目的片段為ITSl時，擴增模板為20_30ng。
[0018] 進一步地，當目的片段為ITS2時，擴增引物為SEQ ID N0:5所示的正向引物： GCATCGCATAAGAACGCAGC;以及SEQIDN0:6所示的反向引物：TCCTCCCCATATTGATATGC ;優選 擴增引物的退火溫度為56?58°C，更優選為57. 6°C。
[0019] 進一步地，當目的片段為ITS2時，擴增模板為15-50ng。
[0020] 應用本發明的技術方案，通過對來自于不同環境的核酸樣本進行準確定量擴增體 系中的模板量，使得不同樣本間目的片段的擴增效率相當，因而使產生的測序數據的波動 性降低；通過對所用引物的退火溫度進行優化，實現了利用普通PCR儀，經過簡單操作，提 供了一種目的片段擴增合格率高、非特異條帶少的擴增文庫構建方法。本發明的上述方法 不僅降低擴增子文庫的構建成本，而且降低擴增子文庫中的非特異擴增子的比例，提高了 擴增子文庫的合格率。
【附圖說明】
[0021] 構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示 意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：
[0022] 圖1示出了根據本發明的一種典型實施方式中擴增子文庫構建的流程示意圖； [0023] 圖2示出了根據本發明的實施例1所提供的16SV4擴增子的電泳檢測結果圖； [0024] 圖3示出了根據本發明的實施例2所提供的ITSl擴增子的電泳檢測結果圖；以及
[0025] 圖4示出了根據本發明的實施例3所提供的ITS2擴增子的電泳檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0026] 需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相 互組合。下面將參考附圖并結合實施例來詳細說明本發明。
[0027] 正如【背景技術】部分所提到的，現有技術的微生物擴增子文庫構建方法中，文庫構 建合格率低且不同樣本間測序數據波動性較大的缺陷，為了改善上述狀況，在本發明一種 典型的實施方式中，提供了一種微生物擴增子文庫的構建方法，如圖1所示，該構建方法包 括以下步驟：S1，對目的片段進行擴增，得到富集目的片段；以及S2,對富集的目的片段進 行片段化文庫構建，得到擴增子文庫；其中，步驟Sl包括以下步驟：S11，對目的片段的擴增 模板進行定量；S12,對目的片段的擴增引物的退火溫度進行固定；以及S13,利用擴增引物 在退火溫度下對目的片段進行擴增，得到富集目的片段。
[0028] 在本發明的上述構建方法中，通過對來自于不同環境的核酸樣本進行準確定量擴 增體系中的模板量，使得不同樣本間目的片段的擴增效率相當，因而使產生的測序數據的 波動性降低；通過對所用引物的退火溫度進行優化，實現了利用普通PCR儀，經過簡單操 作，提供了一種目的片段擴增合格率高、非特異條帶少的擴增文庫構建方法。本發明的上述 方法不僅降低擴增子文庫的構建成本，而且降低擴增子文庫中的非特異擴增子的比例，提 高了擴增子文庫的合格率。
[0029] 在本發明的上述構建方法中，是一種適用于環境微生物擴增子的高效擴增方法， 能在普通的PCR設備上完成擴增，不僅擴增合格率高，而且在擴增中產生的非特異性條帶 少。上述擴增子即目的片段，根據研宄目的的不同，可以是不同的基因或基因組片段。在本 發明一優選的實施例中，上述目的片段可以是16SV4、ITSl或ITS2。上述三個目的片段能 夠根據其片段中的某個高變區來體現環境中微生物的多樣性或環境中微生物群落結構隨 外界環境的變化。
[0030] 在本發明的上述構建方法中，當目的片段為16SV4時，擴增引物為SEQ ID NO: 1所示的正向引物：GTGCCAGCMGMWGCGGTAA ;以及SEQ ID NO:2所示的反向引物： GGACTACHVGGGTWTCTAAT。上述引物是根據其保守序列進行設計，引物之間擴增的目的片段 是不同物種間的可變區，采用上述引物能夠將不同環境中的16SV4的可變區都擴