芋螺毒液管cDNA文庫及其構建方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及構建芋螺毒液管cDNA文庫的方法，具體地，涉及芋螺毒液管cDNA文庫 及其構建方法和用途。更具體，涉及芋螺毒液管cDNA文庫及其構建方法，確定芋螺毒液管 中芋螺毒素肽全長基因序列的方法。
【背景技術】
[0002] 芋螺毒素具有高度遺傳多樣性，其化學結構新穎，富含二硫鍵，且生物活性功能 強，可高選擇性地作用于配體門控離子通道、電壓門控離子通道和G蛋白相關受體等靶標， 并能對各種離子通道亞型及其亞基進行區分，已成為藥理學和神經科學研究的重要工具和 新藥開發的新來源，引起了國際生物學與藥學界的廣泛關注。雖然芋螺毒素種類繁多，但迄 今為止，已發現和研究的芋螺多肽還不到估計總數量的千分之一，這表明芋螺毒液是一個 潛力無限的"天然海洋藥物寶庫"，尚待人類深入的研究、開發與利用。近年來，研究芋螺毒 素、開發成新型神經多肽類藥物已成為國際上的熱門研究方向。
[0003] 傳統的芋螺毒素藥物篩選大多是從自然界活體芋螺的毒液管中分離天然芋螺毒 素，然后直接用于研究和應用或以此作為藥物化學的先導化合物，再進一步設計、加工、合 成，篩選有效的功能藥物。但此方法具有一定的盲目性，篩選周期長。
[0004] 因此，關于芋螺毒素的篩選方面的研究仍有待深入。
【發明內容】
[0005] 本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的 在于提出一種高通量篩選芋螺毒素全長基因的方法。
[0006] 根據本發明的一個方面，本發明提供了一種構建芋螺毒液管cDNA文庫的方法。根 據本發明的實施例，該方法包括以下步驟：將所述芋螺毒液管的總RNA反轉錄為cDNA ;以及 酶切回收所述cDNA中400-1400bp的片段，以便獲得目的片段，所述目的片段構成所述芋螺 毒液管cDNA文庫。由此，利用本發明的方法能夠高效構建針對特異長度目的片段的芋螺毒 液管全長cDNA文庫，進一步基于該cDNA文庫確定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全長基因序列， 能夠有效提聞獲得芋螺毒素的機率。
[0007] 根據本發明的實施例，利用Trizol LS法提取所述芋螺毒液管的總RNA。由此，提 取獲得的芋螺毒液管的總RNA質量較高、完整性好、未降解，且操作簡單，方便快捷。
[0008] 根據本發明的實施例，利用Creator SMART cDNA試劑盒進行所述反轉錄，其中所 述 Creator SMART cDNA 試劑盒中的 CDSIII/3primer 引物被 CDS-3M adapter 代替，所述 CDS-3M adapter 的序列為：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCGAGGCGGCCd(T)20VN-3'。由 此，能夠有效得到RNA序列的反轉錄產物cDNA。
[0009] 根據本發明的實施例，在進行所述酶切回收之前，進一步包括：將所述cDNA進行 均一化處理。由此，降低了文庫中高拷貝存在的cDNA的豐度，提高了發現隨機序列和稀有 基因的幾率，從而能夠獲得更多低豐度的芋螺毒素 cDNA，進而有效克服了基因轉錄水平上 的巨大差異給文庫篩選和分析帶來的障礙。
[0010] 根據本發明的實施例，利用Trimmer-Director試劑盒進行所述均一化處理。由 此，能夠有效實現全長cDNA的均一化，且均一化效果較好。
[0011] 根據本發明的實施例，利用Sfi I Enzyme進行所述酶切。由此，能夠高效對cDNA 進行酶切處理，獲得特定長度的目的片段，提高酶切效率。
[0012] 根據本發明的實施例，利用QIAquick Gel Extraction試劑盒進行所述回收。由 此，目的片段的回收率較高，且操作簡單，方便快捷。
[0013] 根據本發明的實施例，進一步包括對各步驟產物進行純化。由此，可以提高各步驟 產物的質量，利于后續步驟的進行。
[0014] 根據本發明的實施例，進一步包括將所述目的片段連接至載體并轉化至大腸桿菌 中。由此，能夠有效建立芋螺毒液管全長CDNA文庫。
[0015] 根據本發明的另一方面，本發明還提供了一種芋螺毒液管CDNA文庫。根據本發明 的實施例，該芋螺毒液管cDNA文庫是通過期前面所述的構建芋螺毒液管cDNA文庫的方法 構建獲得的。由此，基于本發明的芋螺毒液管cDNA文庫確定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全長 基因序列，能夠有效提1?獲得芋螺毒素的機率。
[0016] 進而，根據本發明的再一方面，本發明還提供了一種確定芋螺毒液管中芋螺毒素 肽全長基因序列的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟：根據前面所述的構建 芋螺毒液管CDNA文庫的方法，構建所述芋螺毒液管的cDNA文庫；對所述cDNA文庫進行測 序，以便獲得測序結果；以及基于所述測序結果，確定所述芋螺毒液管中芋螺毒素肽全長基 因序列。由此，利用本發明的方法能夠大大提高獲得芋螺毒素的機率，能一次性、大量地獲 取芋螺毒素多肽的cDNA序列，并且得到的芋螺毒素序列可信度高，可對轉錄組測序數據進 行驗證，彌補轉錄組數據組裝錯配問題。
[0017] 根據本發明的實施例，利用選自Hiseq2000、S0LID、454和單分子測序裝置的至少 一種進行所述測序。
[0018] 根據本發明的實施例，基于所述測序結果，確定所述芋螺毒液管中芋螺毒素肽全 長基因序列進一步包括：將所述測序結果進行預處理，以便獲得經過預處理的測序結果； 將所述經過預處理的測序結果與芋螺毒素庫進行比對，以便確定所述芋螺毒液管中芋螺毒 素的芋螺毒素肽全長基因序列。由此，可以高效確定芋螺毒素肽全長基因序列，準確度較 商。
[0019] 需要說明的是，本發明至少具有以下優點：
[0020] (1)本發明是基于編碼芋螺毒素肽的mRNA構建全長CDNA文庫，獲得芋螺毒素的完 整開放閱讀框（0RF)，進而獲得全長的芋螺毒素前體肽；
[0021] (2)均一化處理可以獲得更多低豐度的芋螺毒素 cDNA ;
[0022] (3)切取針對特異長度的目的片段cDNA，能夠大大提高獲得芋螺毒素的機率；
[0023] (4)本發明利用的高通量測序方法能一次性、大量地獲取芋螺毒素多肽的cDNA序 列；
[0024] (5)利用本發明的方法得到的芋螺毒素序列可信度高，可對轉錄組測序數據進行 驗證，彌補轉錄組數據組裝錯配問題。
[0025] 本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【附圖說明】
[0026] 本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中 ：
[0027] 圖1顯示了根據本發明一個實施例的芋螺毒素總RNA的電泳檢測圖；
[0028] 圖2顯示了根據本發明一個實施例的二鏈cDNA合成后的電泳檢測圖；
[0029] 圖3顯示了根據本發明一個實施例的經過均一化處理的cDNA電泳檢測圖；
[0030] 圖4顯示了根據本發明一個實施例的經過均一化處理的cDNA二次PCR擴增產物 的電泳檢測圖；以及
[0031] 圖5顯示了根據本發明一個實施例的菌落PCR電泳檢測圖。
【具體實施方式】
[0032] 下面詳細描述本發明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發 明，而不能理解為對本發明的限制。
[0033] 芋螺毒液管cDNA文庫及其構建方法
[0034] 根據本發明的一個方面，本發明提供了一種構建芋螺毒液管cDNA文庫的方法。根 據本發明的實施例，該方法包括以下步驟：將所述芋螺毒液管的總RNA反轉錄為cDNA ;酶切 回收所述cDNA中400-1400bp的片段，以便獲得目的片段，所述目的片段構成所述芋螺毒液 管cDNA文庫。由此，利用本發明的方法能夠高效構建針對特異長度目的片段的芋螺毒液管 全長cDNA文庫，進一步利用該cDNA文庫確定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全長基因序列，能夠 有效提1?獲得芋螺毒素的機率。
[0035] 根據本發明的實施例，提取所述芋螺毒液管的總RNA的方法不受特別限制，只要 能夠獲得完整、未降解的RNA，本領域技術人員可以根據具體情況靈活選擇。根據本發明的 一個實施例，利用Trizol LS法提取所述芋螺毒液管的總RNA。由此，提取獲得的芋螺毒液 管的總RNA質量較高、完整性好、未降解，且操作簡單、方便快捷。
[0036] 根據本發明的實施例，所述反轉錄的方法不受特別限制，只能能夠有效獲得芋螺 毒素全長cDNA，本領域技術人員可以根據具體實驗條件進行選擇。根據本發明的一個實施 例，利用Creator SMART cDNA試劑盒進行所述反轉錄，其中所述Creator SMART cDNA試 劑盒中的⑶SIII/3primer引物被Q3S-3M adapter代替，所述Q3S-3M adapter的序列為： 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCGAGGCGGCCd(T)20VN-3'（SEQ ID N0:1，其中，該 CDS-3M adapter 序列也可以直接表示為：5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCGAGGCGGCCnTTITITT TTTTTTTTTTTVN-3'）。由此，能夠有效得到RNA序列的反轉錄產物cDNA。
[0037] 根據本發明的實施例，在進行所述酶切回收之前，需要將所述cDNA進行均一化處 理。根據本發明的一個實施例，對將所述cDNA進行均一化處理的方法