檢測金魚造血器官壞死病病毒的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及用于檢測金魚造血器官壞死病病毒的熒 光定量PCR引物和探針，本發明還涉及利用該引物和探針進行金魚造血器官壞死病病毒檢 測的方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 金魚造血器官壞死病病毒（goldfish haematopoietic necrosis virus, GFHNV)， 也稱為鯉皰疫病毒-2 (cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)，是金魚造血器官壞死病 (goldfish haematopoietic necrosis，GFHN)的病原，是一種感染金魚（Carassius auratus)、鯽（Carassius auratus)及其變種的高致病性雙鏈DNA病毒。該病毒曾在日本、 澳大利亞、新西蘭、英國、匈牙利及我國臺灣爆發疫病，發病金魚死亡率可達100%。
[0003] 目前，國內外缺乏對GFHNV敏感的細胞系以及抗GFHNV的抗體，因此無法使用病 毒分離和免疫學方法檢測該病毒。對該病毒的檢測方法的研究主要集中于建立分子生物學 檢測方法檢測病毒核酸，包括PCR方法、熒光定量PCR方法和環介導等溫擴增技術（LAMP) 檢測方法。
[0004] 目前報道的針對GFHNV的PCR檢測方法，其檢測限低于熒光定量PCR檢測方法和 LAMP檢測方法，而且需要對擴增產物進行凝膠電泳才能觀察結果，易造成溴化乙錠污染； LAMP檢測方法如果反應時間過長，容易產生假陽性，且由于產物過多，也容易造成核酸污 染；目前報道的某些熒光定量PCR檢測方法不穩定，檢測結果有時會產生假陰性。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供用于檢測金魚造血器官壞死病病毒的特異性引物和探針。
[0006] 本發明的另一個目的在于提供檢測金魚造血器官壞死病病毒的熒光定量PCR方 法及其試劑盒。
[0007] 為實現上述目的，本發明對已知金魚造血器官壞死病病毒特異基因的DNA序列進 行比對，篩選出金魚造血器官壞死病病毒基因的特異序列，即GFHNV主衣殼蛋白（MCP)基因 中一段保守序列（2307-2464)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本發明提供用于檢測金魚造血器官壞死病病毒上述特異序列的引物，以及與所述 引物配合使用的熒光探針。其中，探針5'標記熒光基團FAM，3'標記TAMRAN。該特異引物 擴增產物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 在本發明的一個實施方式中，優選的引物序列為：
[0010] 上游引物：CAAACCCAGCACCGTCAGATGGT (SEQ ID NO. 2)
[0011] 下游引物：ATCCGGCACAGGTGGCGTGT(SEQ ID NO. 3)。
[0012] 熒光探針序列為：
[0013] 5'-FAM-TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAG-TAMRAN(SEQ ID NO. 4)。
[0014] 本發明提供了上述引物和熒光探針在制備檢測金魚造血器官壞死病病毒試劑盒 中的應用。
[0015] 本發明提供一種金魚造血器官壞死病病毒的實時熒光定量PCR檢測方法，包括以 樣品總DNA為模板，利用本發明提供的引物和探針進行實時熒光定量PCR，同時設立無模板 對照和陽性對照，根據擴增曲線判定結果。
[0016] 本發明的實時熒光定量PCR擴增反應體系，當為25 μ L反應體系時，其優選配置 為：
[0017] 試劑 體積（μ?ν) IOxPCR Buffer ( 15mM MgCl2) 2.5 dNTP (2.5mM each) 2.0
[0018] Tag polymerase ( 5U ) 0.5 上游引物（lOpmol/ul) 1.5 下游引物（lOpmol/ul) 1.5 探針（lOpmol/ul ) I DNA模版 I MgCl2 ( 25mM ) 2 CldH2O 丨3 。
[0019] 本發明的實時熒光定量PCR的反應程序為：95°C預變性3min，I個循環；95°C變性 30s，55?65°C退火30s，40個循環。
[0020] 本發明優選的實時熒光定量PCR的反應程序為：95°C預變性3min，1個循環；95°C 變性30s，59 °C退火30s，40個循環。
[0021] 本發明每次檢測標本時須設立陰性對照和陽性對照，在檢測中兩種對照為有效擴 增時，樣本結果判斷標準如下：
[0022] Ct值彡38. 0時樣品結果為陽性；Ct值> 38. 0的樣品結果為陰性。
[0023] 本發明提供了 一種用于金魚造血器官壞死病病毒檢測的試劑盒，其包括上述能特 異地擴增出如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列或其特異性片段的引物以及配合引物使用的 Taqman 探針。
[0024] 本發明試劑盒的所用引物序列為：
[0025] 上游引物：CAAACCCAGCACCGTCAGATGGT(SEQ ID NO. 2)
[0026] 下游引物：ATCCGGCACAGGTGGCGTGT(SEQ ID NO. 3)。
[0027] 突光探針序列為：
[0028] 5,-FAM-TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAG-TAMRAN(SEQ ID NO. 4)。
[0029] 本發明提供的試劑盒，還包括DNA裂解液，熒光定量反應液，陰性模板和陽性模 板，所述陰性模板為雙蒸水，所述陽性模板為金魚造血器官壞死病病毒基因組DNA。
[0030] 本發明提供了用于檢測金魚造血器官壞死病病毒的特異性引物和探針，建立了檢 測金魚造血器官壞死病病毒的熒光定量PCR方法，具有很高的檢測靈敏度，可以檢測到100 個拷貝的金魚造血器官壞死病病毒DNA ;該方法特異性強，其重復性好，可作為檢測臨床標 本的手段，提高金魚造血器官壞死病病毒檢測的陽性率，操作簡單，檢測過程僅需90分鐘， 大大縮短檢測周期，檢測結果使用熒光定量PCR儀直接觀察，不存在溴化乙錠污染的問題。 本發明提供的檢測試劑盒，其反應體系包含了上述引物、探針和陰性、陽性對照，該試劑盒 的推廣應用將為防治和監測金魚造血器官壞死病病毒病提供技術支持。
【附圖說明】
[0031] 圖1為金魚造血器官壞死病病毒熒光定量PCR特異性評價，圖中曲線為金魚造血 器官壞死病病毒的反應曲線；
[0032] 圖2為金魚造血器官壞死病病毒熒光定量PCR檢測限測定（1)，圖中4-10號曲線， 分別依次對應DNA模板量為IO4拷貝-IO ltl拷貝的反應體系擴增出的反應曲線。
[0033] 圖3為金魚造血器官壞死病病毒熒光定量PCR標準曲線（1)
[0034] 圖4為金魚造血器官壞死病病毒熒光定量PCR檢測限測定（2)，圖中1-5號曲線， 分別依次對應DNA模板量為IO 1拷貝-IO5拷貝的反應體系擴增出的反應曲線。
[0035] 圖5為金魚造血器官壞死病病毒熒光定量PCR標準曲線（2)
【具體實施方式】
[0036] 以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明 的范圍。
[0037] 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0038] 實施例1金魚造血器官壞死病病毒特異性引物和探針的設計
[0039] 對已知金魚造血器官壞死病病毒特異基因的DNA序列進行比對，篩選出金魚造 血器官壞死病病毒基因的特異序列，即GFHNV主衣殼蛋白（MCP)基因中一