血液直接pcr法檢測葉酸代謝相關基因多態性的引物、引物組、試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學檢測，尤其涉及一種血液直接PCR法檢測葉酸代謝相關基 因多態性的引物、引物組、試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 葉酸屬B族維生素，是合成核酸所必須的元素，是細胞生長和組織修復所必需的 物質，更是胚胎發育過程中不可缺少的營養素。近年來大量研究已經證實，葉酸缺乏是導致 出生缺陷的主要原因。葉酸的臨床功能除了預防胎兒神經管缺陷外，還能降低孕婦妊娠高 血壓、自發性流產和胎兒宮內發育遲緩、早產以及新生兒低出生體重等發病率。
[0003] 科學研究發現，葉酸利用能力受遺傳結構(基因）影響，如果與葉酸代謝相關的酶 活性偏低（即相關基因功能異常)，這一人群如按常量（400微克/天)補充葉酸，機體葉酸水 平也會不足。遺傳體質的差異導致了機體對葉酸利用能力的差異，因此，葉酸增補應因人而 異，增補過多或過少都不利于胎兒健康和孕婦健康。
[0004] 科學研究已經證實，與甲基類維生素（葉酸及維生素 B12)代謝密切相關的基因是 MTHFR和MTRR。MTHFR編碼蛋白5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶，MTRR編碼蛋白甲硫氨酸合 成酶還原酶。MTHFR和MTRR基因變異會引起相應的酶活性降低，阻抑同型半胱氨酸轉化為 甲硫氨酸，導致低葉酸血癥和高同型半胱氨酸血癥，從而增加新生兒出生缺陷風險或自發 性流產等風險。
[0005] MTHFR 全稱 5, l〇-methylenetetrahydrofolatereductase(5, 10-亞甲基四氫葉酸 還原酶)，位于一號染色體1ρ36. 3位置。MTHFE全長19. 3kb，mRNA全長7105bp，共有外顯子 12個，編碼共有657個氨基酸編碼子的蛋白。亞甲基四氫葉酸還原酶催化5, 10-亞甲基四 氫葉酸轉換成5-甲基四氫葉酸鹽，使之能為同型半胱氨酸提供甲基甲硫氨酸。該酶是人體 葉酸代謝中的一個十分重要的酶。
[0006] MTRR 全稱 5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase reductase,編碼甲硫氨酸合成酶還原酶，位于5pl5.3-pl5. 2。MTRR基因全長32021 kb， mRNA全長3274bp，共有15個外顯子，編碼具有726個氨基酸的蛋白質。甲硫氨酸是蛋白質 合成和一碳代謝的必須氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶（MTR編碼)催化的，而甲硫氨酸 合酶因為輔助因子維生素 B12被氧化而最終失活。MTRR編碼的甲硫氨酸合成酶還原酶能夠 通過還原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。甲硫氨酸合成酶還原酶是 具有電子轉移作用的鐵氧化還原蛋白-NADP ( + )還原酶（ferredoxin-NADP ( + )reductase， FNR)家族成員。MTRR突變是造成葉酸/甲基維生素缺乏癥的主要病因。
[0007] CN103834733A(2014-6-4)公開了一種單管聯合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基 四氫葉酸還原酶基因突變位點的試劑盒及其測定方法，所述試劑盒包括：全血基因組DNA 提取試劑、多重PCR擴增引物、多重PCR擴增反應試劑、單鏈DNA分離和純化試劑、焦磷酸測 序引物、焦磷酸測序試劑和盒體。所述方法：人類全血基因組DNA提取；多重PCR擴增反應； 單鏈DNA樣本分離和純化；焦磷酸測序與結果分析。用途：希望了解個體對乙醇和葉酸代謝 能力情況的健康體檢者；預測個體對硝酸甘油代謝能力和療效，指導心梗患者合理選擇和 備用血管舒張急救藥物；預測個體對葉酸的代謝能力，指導孕產婦和兒童補充適合劑量的 葉酸補充劑等。然而該方法需要抽提基因組DNA。
[0008] 目前市面上檢測5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因（MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還 原酶基因（MTRR)上的3個SNP位點多態性的方法都是需要從人全血或口腔上皮組織中 抽提人基因組DNA，然后在熒光定量PCR儀上，利用熒光探針或熒光染料法進行熒光定量 PCR，根據熒光信號強弱或溶解曲線來判斷突變類型。這些方法雖然可以做到當天出結果， 但是不適合國內二三線城市的醫院或婦幼保健院內檢測。原因如下： 1、 熒光定量PCR儀價格昂貴，國產儀器售價也超過三十萬元，不是所有醫院都能配備； 2、 試劑盒在不同廠家或不同型號的熒光定量PCR儀上判讀方法或結果不一致，需要做 預實驗或測序驗證后才能大規模檢測； 3、 需要抽提基因組DNA，額外增加檢測人員工作量及檢測成本，并且容易造成樣本污 染。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的之一是提供一種無需抽提人基因組DNA，而從全血直接PCR，無需昂 貴的熒光定量PCR儀，檢測5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號SNP位點的 血液直接PCR法檢測葉酸代謝相關基因多態性的引物。
[0010] 本發明的目的之二是提供一種無需抽提人基因組DNA，而從全血直接PCR，無需昂 貴的熒光定量PCR儀，檢測5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801131號SNP位點的 血液直接PCR法檢測葉酸代謝相關基因多態性的引物。
[0011] 本發明的目的之三是提供一種無需抽提人基因組DNA，而從全血直接PCR，無需昂 貴的熒光定量PCR儀，檢測甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP位點的血液直 接PCR法檢測葉酸代謝相關基因多態性的引物。
[0012] 本發明的目的之四是提供一種無需抽提人基因組DNA，而從全血直接PCR，無需昂 貴的熒光定量PCR儀，同時檢測5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號SNP位 點、5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801131號SNP和甲硫氨酸合成酶還原酶基 因上rsl801394號SNP位點的血液直接PCR法檢測葉酸代謝相關基因多態性的引物組。
[0013] 本發明的目的之五是提供一種無需抽提人基因組DNA，而從全血直接PCR，無需昂 貴的熒光定量PCR儀，同時檢測5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號SNP位 點、5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801131號SNP和甲硫氨酸合成酶還原酶基 因上rsl801394號SNP位點的、通過PCR產物測序來判斷的血液直接PCR法檢測葉酸代謝 相關基因多態性的試劑盒。
[0014] 本發明的目的之六是提供一種無需抽提人基因組DNA，而從全血直接PCR，無需昂 貴的熒光定量PCR儀，同時檢測5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號SNP位 點、5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801131號SNP和甲硫氨酸合成酶還原酶基 因上rsl801394號SNP位點的、通過PCR產物測序來判斷的血液直接PCR法檢測葉酸代謝 相關基因多態性的檢測方法。
[0015] 本發明的第一技術目的是通過以下技術方案得以實現的： 血液直接PCR法檢測葉酸代謝相關基因多態性的引物，其包括以下引物對： (1)正向引物 MTRR-PF，其核苷酸序列 SEQ ID N0.1: atgccttgaagtgatgag; 反向引物 MTRR-PR，其核苷酸序列 SEQ ID N0.2: actgtaacggctctaacc;和 / 或 (2 )由正向引物MTRR-PF或反向引物MTRR-PR的核苷酸序列經增加、缺失或替換單個核 苷酸得到的引物； 上述引物對應的目的基因為5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因，以該基因為模板擴增 所得DNA片段包含rsl801133號SNP位點。
[0016] 本發明設定并合成特定的所述特異性引物，可檢測5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶 基因上rsl801133號SNP位點。
[0017] 本發明的第二技術目的是通過以下技術方案得以實現的： 血液直接PCR法檢測葉酸代謝相關基因多態性的引物，其包括以下引物對： (1)正向引物 MTHFR-677PF，其核苷酸序列 SEQ ID NO. 3: AGGACAGTGTGGGAGTTTGG; 反向引物MTHFR-677PR，其核苷酸序列 SEQ ID NO. 4: GAAAAGCTGCGTGATGATGA;和 / 或 (2 )由正向引物MTHFR-677PF或反向引物MTHFR-677PR的核苷酸序列經增加、缺失或替 換單個核苷酸得到的引物； 上述引物對應的目的基因為5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因，以該基因為模板擴增 所得DNA片段包含rsl801131號SNP位點。
[0018] 本發明設定并合成特定的所述特異性引物，可檢