用于microRNA-146a基因及前區(qū)內(nèi)單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的擴(kuò)增和測(cè)序引物及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和DNA測(cè)序技術(shù)的分子生物學(xué)方法,尤其涉 及一種用于microRNA(miR) 146a基因及其基因前區(qū)內(nèi)5個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)的擴(kuò) 增和測(cè)序引物及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 微小RNA(microRNA,miR)是內(nèi)源性的長(zhǎng)度約19-21核苷酸的單鏈非編碼RNA,能夠 調(diào)節(jié)編碼基因的表達(dá)。這些RNA分子以錯(cuò)綜復(fù)雜的方式調(diào)節(jié)蛋白的水平而不是完全抑制靶 基因的表達(dá)。盡管這些作用可能很輕微,但有大量的基因受miR調(diào)控,表明它們是很重要的 調(diào)節(jié)分子。目前大家都認(rèn)同miR在許多復(fù)雜的生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用,比如胚胎發(fā) 育、組織識(shí)別、增殖、分化、凋亡、信號(hào)通路、新陳代謝、腫瘤和病毒感染等。近來(lái)還發(fā)現(xiàn)miR 與自身免疫性疾病有關(guān)。在眾多miR中,miR-146a是研宄熱點(diǎn)。
[0003] 此miRNA的生物合成過(guò)程主要包括miRNA基因轉(zhuǎn)錄、核內(nèi)前體RNA合成、核輸 出、胞楽加工和裝配等。MiR_146a rs2910164G/C等位基因位于pre-miR_146a的第60 個(gè)核苷酸,即在miR-146a上。等位基因 C會(huì)引起pre-miR-146a發(fā)卡結(jié)構(gòu)的錯(cuò)配,使Λ G 從-43. lkcal/mol 降為-40. 3kcal/mol,從而降低 pri-miR 的穩(wěn)定性、pri-miR 形成 pre-miR 的效率或者 pre-miR 形成 miR-146a 的效率。而 rs2431697、rs57095329、rs6864584、 rs2277920位于miR-146a基因的之前的基因間隔區(qū),可能影響miR-146a的表達(dá)效率。目前, 這些單核苷酸多態(tài)性研宄較多的是與疾病相關(guān)性研宄,包括腫瘤、銀肩性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬 化、結(jié)核、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有分子診斷技術(shù)中檢測(cè)miR-146a所要包含的SNP類型多、 檢測(cè)不全面的缺陷,提供一套優(yōu)化引物用于PCR擴(kuò)增和測(cè)序,能在相同條件下一次性進(jìn)行4 個(gè)PCR,順利對(duì)包含miR-146a的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。
[0005] 本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種配套此引物進(jìn)行miR-146a基因及前區(qū)序列內(nèi)5個(gè) SNP檢測(cè)的特定的PCR反應(yīng)程序,達(dá)到快速擴(kuò)增的目的。
[0006] 本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行miR-146a基因及其前區(qū)序列內(nèi) SNP進(jìn)行序列分析的熒光PCR擴(kuò)增試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0008] 用于microRNA-146a基因及前區(qū)內(nèi)單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的擴(kuò)增和測(cè)序引物,包括 含rs2431697核酸片段的擴(kuò)增和測(cè)序引物為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2,含rs57095329 和rs6864584核酸片段的擴(kuò)增和測(cè)序引物為SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4,含rs2277920核 酸片段的擴(kuò)增和測(cè)序引物為SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6,含rs2910164核酸片段的擴(kuò)增和 測(cè)序引物為 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8。
[0009]配套擴(kuò)增包括 rs2431697、rs57095329、rs6864584、rs2277920、rs2910164 核酸片 段的PCR反應(yīng),為95°C預(yù)變性3min后,94°C變性15s,56°C退火15s,72°C延伸35s,進(jìn)行35 個(gè)循環(huán),然后保存在25°C ;及時(shí)取出進(jìn)行測(cè)序。
[0010] 一種用于micr〇RNA-146a基因及前區(qū)內(nèi)單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的擴(kuò)增和測(cè)序試劑 盒:
[0011] 試劑A :由2mL緩沖液組成,包含2 X SYBR? Green I染料,0. 2mM dNTPs (包括dATP、 dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris-HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2S04、6mM MgS04、100U Taq DNA 聚 合酶;
[0012] 試劑SI :由針對(duì)含rs2431697核酸片段的測(cè)序引物30 μ L水溶液,包含4 μ MSEQ ID NO. 2 ;
[0013] 試劑S2 :由針對(duì)含rs57095329和rs6864584核酸片段的測(cè)序引物30 μ L水溶液, 包含 4 μ M SEQ ID NO. 4 ;
[0014] 試劑S3:由針對(duì)含rs2277920 核酸片段的測(cè)序引物30μL水溶液,包含4μMSEQ ID NO. 6 ;
[0015] 試劑S4:由針對(duì)含rs2910164 核酸片段的測(cè)序引物30μL水溶液,包含4μMSEQ ID NO. 8 ;
[0016] 包被引物的PCR反應(yīng)管:
[0017] -號(hào)反應(yīng)管:含有針對(duì)含rs2431697核酸片段的擴(kuò)增引物混合組成,包含 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 1 和 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 2 ;
[0018] 二號(hào)反應(yīng)管:含有針對(duì)含rs57095329和rs6864584核酸片段的擴(kuò)增引物混合組 成,包含 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 3 和 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 4 ;
[0019] 三號(hào)反應(yīng)管:含有針對(duì)含rs2277920核酸片段的擴(kuò)增引物混合組成,包含 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 5 和 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 6 ;
[0020] 四號(hào)反應(yīng)管:含有針對(duì)A含rs2910164核酸片段的擴(kuò)增引物混合組成,包含 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 7 和 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 8 ;
[0021] 五號(hào)反應(yīng)管:同一號(hào)管;
[0022] 六號(hào)反應(yīng)管:同二號(hào)管;
[0023] 七號(hào)反應(yīng)管:同三號(hào)管;
[0024] 八號(hào)反應(yīng)管:同四號(hào)管。
[0025] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn):
[0026] 1)提供了一套可進(jìn)行快速PCR的引物和優(yōu)化的測(cè)序引物,一次性擴(kuò)增所有 miR-146a所有5個(gè)SNP的序列用于后續(xù)測(cè)序;2)反應(yīng)體系中帶熒光染料,可以直接通過(guò)熒 光定量PCR觀察擴(kuò)增結(jié)果,避免電泳帶來(lái)的不便和污染;3)引物直接包被在反應(yīng)管中,避免 引物配置困難。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,組成簡(jiǎn)單、快速、靈敏、特異的檢測(cè)試劑 盒,可用于對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè),可減少人力和物力,提供更多的實(shí)驗(yàn)信息。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為miR-146a基因及前區(qū)內(nèi)的SNP分布。
[0028] 圖2為人miR-146a基因及前區(qū)內(nèi)SNP的測(cè)序結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0030] 本發(fā)明的擴(kuò)增和測(cè)序引物核苷酸序列為:
[0031] SEQ ID NO. 1 5' -attatgattggcaaatggaagg-3'
[0032] SEQ ID NO. 2 5' -tttggctggatggaggat-3'
[0033] SEQ ID NO. 3 5' -attgggcagccgataaag-3'
[0034] SEQ ID NO. 4 5' -ctcctcgttgtgctactgtctc-3'
[0035] SEQ ID NO. 5 5' -ggagacagtagcacaacgag-3'
[0036] SEQ ID NO. 6 5' -tagccatagtcttccaaccc-3'
[0037] SEQ ID NO. 7 5' -cccacatcagccttccag-3'
[0038] SEQ ID NO. 8 5' -ccaggtcctcaagcccac-3'
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