一種西瓜枯萎病菌的檢測引物、檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農作物病害檢測鑒定及植物檢疫的領域，具體是一種西瓜枯萎病菌的 檢測引物、檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 西瓜枯萎病俗稱蔓割病或萎蔫病，是由尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum)引起的一種世界性瓜類土傳病害。它的發生極為普遍，對西瓜產 量和品質構成了嚴重的威脅，是西瓜生產上的重要病害。目前，對這類維管束病害的有效防 治方法主要是依靠抗病品種選育，但可供選育的抗病品種抗源單一，效率不高。有研宄人員 從西瓜根際土壤中篩選出對西瓜枯萎病菌防治效果好、無污染土壤中生存良好的放線菌菌 株XF9、XF18和XF22,能較好的防治西瓜枯萎病。三種有益微生物為生物農藥的研發奠定 了基礎，也為西瓜枯萎病上拮抗菌的拮抗機制奠定了理論基礎。國際上公認的西瓜枯萎病 菌有3個生理小種，即生理小種0號、1號和2號，其中2號生理小種的侵染性最強。除以上 3個生理小種外，還有其他的小種分化，生理小種3于2010年鑒定分離，但在中國尚未見報 道，需進一步證實。傳統上對西瓜枯萎病菌的鑒定主要是采用形態特征的比較法，即對不同 地區的西瓜枯萎病菌分離物進行形態特征（如菌落顏色、菌落密度、大小孢子的大小與形 狀以及菌落直徑等）的比較。但利用傳統的鑒定方法來鑒別病原菌準確性不高，已不能滿 足生產的要求。近年來，隨著分子生物學技術的發展，包括AFLP、RFLP、RAPD以及SCAR在內 的分子檢測技術在病原菌鑒定、分類及群體遺傳多樣性研宄中得到植物病理學家的高度重 視。基于特異基因組設計的特異性引物已經廣泛應用于病原菌的分子檢測，前人基于特異 性引物成功建立了快速檢測雙重PCR技術已用于檢測水稻白葉枯病菌和細菌性條斑病菌、 小麥條紋花葉病毒和小麥花葉病毒等植物病原菌的分子鑒定體系。目前在尖孢鐮刀菌的分 子檢測方面，有研宄人員利用甘藍枯萎病菌特異性引物Focs-l/Focs-2和尖孢鐮刀菌通用 引物W106R/W106F建立了檢測甘藍枯萎病菌的多重PCR檢測體系。該技術既可應用于甘藍 枯萎病發病區病情的檢測，也可從發病植株中檢測出甘藍枯萎病菌。而對于西瓜枯萎病菌 的分子檢測，有研宄人員把西瓜枯萎病菌和西瓜蔓枯病菌的2對特異性引物Fn-l/Fn-2和 Mn-l/Mn-2置于同一反應中，建立了檢測西瓜枯萎病菌和蔓枯病菌的雙重PCR體系，但這種 雙重PCR體系適用于檢測兩種病原菌，雙重PCR只檢測西瓜枯萎病菌的方法在國內外都未 見報道。
【發明內容】
[0003] 為解決現有技術中通過形態特征檢測西瓜枯萎病菌不精確、操作不簡便的缺陷， 本發明公開了一種西瓜枯萎病菌檢測試劑盒及其檢測方法，其實現的目的是，從生物分子 層面上、以高精確度檢測出西瓜枯萎病菌，并且采用該試劑盒以及檢測方法操作簡便、特異 性強且靈敏度高，對于西瓜枯萎病菌引起病害顯癥之前的早期檢測和診斷具有十分重要的 意義。
[0004] 為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是，本發明公開了檢測西瓜枯萎病 菌的檢測引物，由枯萎病菌通用引物和只能特異的擴增西瓜枯萎病菌的引物組成的雙重 檢測引物集，其中，枯萎病菌通用引物對，？〇8-1? :5'-60461^6了4061^41^64(：(：-3'，下游引 物序列為Fos-S : 5 ' -CCATGGCAGATGGCGAGTCA-3 ' ；特異性擴增西瓜枯萎病菌的引物對， 其上游引物序列為Fow-R :5' -CCCGCTGGCTACTAATCTTTGA-3'，下游引物序列為：Fow-S : 5' -ATGTAGTGGCGATACTTCCTTG-3' ；本檢測試劑盒中的檢測雙重檢測引物集，其中Fos為公 開發表的用于檢測枯萎病菌的引物對，而特異性擴增西瓜枯萎病菌的引物對則為本實驗室 通過對西瓜枯萎病菌進行全基因組測序，并通過比較基因組學的方法找出西瓜枯萎病菌特 異于其他枯萎病菌的基因組片段，然后針對西瓜枯萎病菌的特異片段序列設計出了一系列 引物對，并對這些引物對進行篩選，篩選出那些擴增的特異性強，并且不會和Fos引物相互 干擾的引物對。最后得到的Fow引物能夠特異擴增出一條491bp的條帶，該引物對靈敏度 高、特異性強，能夠用于帶西瓜枯萎病菌的快速、精確的分子檢測。
[0005] 本發明還公開了包含上述檢測引物的檢測試劑盒，包括均為Iyl的枯萎病菌通 用引物和特異性擴增西瓜枯萎病菌的引物，且兩種引物中上游引物與下游引物的體積比為 I : l、2XTaq Master Mix(Dye ?1118)12.5以1、1以1的西瓜枯萎病菌陽性對照0嫩、重量濃 度多99%的超純水9.5μ1。檢測引物與其它輔助試劑混合，在后續PCR擴增程序時，能夠 很好地溶解引物，且對于擴增程序不會帶來影響，使其能清晰的顯示出擴增產物亮帶。
[0006] 本發明還公開了采用所述試劑盒檢測西瓜枯萎病菌的方法，該方法包括如下步 驟，（1)提取被西瓜枯萎病菌感染的植物組織DNA ;
[0007] ⑵采用檢測試劑盒對（1)步分離出的DNA進行PCR擴增；
[0008] (3)將6 μ 1步驟（2)的PCR擴增產物用質量濃度為1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離， 分離后再經溴化乙錠染色于紫外燈下，根據擴增產物的大小判定結果，當特異性地擴增出 491bp產物時，即可判斷植物組織中存在西瓜枯萎病菌。
[0009] 作為優選的實施例，所述步驟（1)的提取方法包括如下步驟：①取250mg西瓜枯 萎病菌菌體液氮、石英砂充分碾磨成白色粉末狀，裝入IOml離心管；在離心管中加入4ml 65°C預熱的CTAB提取液、60 μ 1 β -巰基乙醇，劇烈振蕩至樣品分散均勻；再將離心管65°C 水浴45min，其間顛倒2?3次；加入0. 25體積的無水乙醇和0. 11體積的5mol/L醋酸鉀， 充分混勻，于冰上放置Ih;
[0010] ②經①步處理后將上述混合物于55?60°C水浴I. 5h，每IOmin顛倒混勾一次，水 浴1. 5小時后離心15min，離心速度為12, OOOrpm ;
[0011] ③離心后取上清液加入與上清液等體積的酚、氯仿和異戊醇混合溶液，所述混合 溶液中酚：氯仿：異戊醇的體積比為：25 : 24 : 1，離心5min，離心速度為12, OOOrpm ;
[0012] ④經③步離心后取上清液，即水相，加入等體積氯仿抽提一次，離心5min，離心速 度為12,000rpm，收集上清液；
[0013] ⑤向④步上清液加入0. Iml的質量濃度為3m01/L NaAC溶液和2ml的-20°C無水 乙醇，-20°C下沉淀30min后12, OOOrpm離心5min，輕輕地倒去上清液；
[0014] ⑥向⑤步棄去上清液的沉淀部分加入700 μ 1體積濃度70 %的-20°C乙醇進行洗 滌，在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后用IXTE溶液進行溶解，得到菌株的DNA溶液，用 紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至50ng/μ 1待用。所述步驟（1)利用改良的CTAB 法提取被西瓜枯萎病菌感染的植物組織DNA時，該方法和傳統用于真菌基因組DNA提取的 CTAB法相比，其得到的基因組DNA更加完整，其檢測的電泳條帶更加清晰。
[0015] 進一步的，所述步驟①中的CTAB提取液包括質量濃度為2%的CTAB，lOOmmol/L、 pH 8. 0 的 Tris-HCl，20mmol/L、ρΗ8· 0 的 EDTA，L 4mol/L 的 NaAC。
[0016] 所述步驟⑵的擴增方法包括：①取⑴步的DNAl μ 1，將其與試劑盒的試劑混 合；
[0017] ②將①步的混合物放入PCR儀器中進行擴增，PCR擴增程序為：94°C預變性5min ; 94°C變性 40sec ;60°C退火 30sec ;72°C延伸 IOOsec ;30 個循環最后 72°C延伸 lOmin。
[0018] 本發明方法適用于植物組織樣品中西瓜枯萎病菌的快速可靠檢測和鑒定，對于農 業生產中西瓜枯萎病菌引起的病害防治具有重要的實用價值。本發明與現有技術相比，具 有以下的技術優勢和積極效果：
[0019] 1、精確度高：本發明檢測方法是利用比較基因組學方法對西瓜枯萎病菌和其他枯 萎病菌的全基因組序列進行分析得到西瓜枯萎病菌的特有片段，根據特異片段設計引物進 行檢測。已經對源于來自我國北京、山西省及國外的西瓜枯萎病菌和尖孢鐮刀菌近緣種及 其他常見病菌的驗證，本發明設計的特異性引物具有很強的特異性，因此能夠高精準度地 檢測出西瓜枯萎病菌；
[0020] 2、操作簡便：本發明采用的技術方案是在生物分子層面上進行的檢測，傳統的檢 測方法，需要生物學的專家以形態特征進行檢測，因此本發明操作簡便，可用于帶西瓜枯萎 病菌的植物組織的高靈敏度快速分子檢測，滿足對發病植物組織中存在的西瓜枯萎病菌進 行快速可靠的檢測和鑒定的需要。
【附圖說明】
[0021] 圖1、本發明和傳統的CTAB法提取真菌基因組DNA電泳圖；
[0022] 圖中，1，2為傳統CTAB法提取的真菌基因組DNA ;3,4本發明提取的真菌基因組 DNA ；
[0023] 圖2、根據特異片段設計的不同引物PCR擴增出的產物對比圖；
[0024] 圖中，條帶從上往下依次對應 5kb、3kb、2kb、lkb、750bp、500bp、250bp、，100bp，M : Trans2kplus marker ;1_14分別對應著設計的14對特異引物對西瓜枯萎病菌基因組DNA進 行擴增的電泳圖；
[0025] 圖3、利用PCR對12組雙重檢測引物進行篩選結果的電泳圖；
[0026] 圖中，M :Trans2kplus marker ;1-12為12組雙重檢測引物集PCR的電泳圖，每組 雙重檢測引物集中包含一對枯萎病菌通用引物對及篩選的西瓜枯萎病菌特異引物對；
[0027] 圖4、本發明雙重檢測引物對各種枯萎病菌檢測的電泳圖；
[0028] 圖中，M :Trans2kplus marker ;Fuw_BN3 :西瓜枯萎病生理小種 0# ;1_1，1-5， 1-9 :西瓜枯萎病生理小種1# ;2-1，2-2,2-3 :西瓜枯萎病生理小種2# ;A5-beans :枯萎病 菌菜豆專化型；F-pepper-Fl :枯萎病菌辣椒專化型；Foc-banana-4 :枯萎病菌香蕉專化 型；cotton :枯萎病菌棉花專化型；Fuc-BN-8 :枯萎病菌黃瓜專化型；F-eggplant-Fll : 枯萎病菌前子專化型；F-tomato-DBl :枯萎病菌番前專化型；Lettuce :枯萎病菌萬苣專 化型；Foc :枯萎病菌甘藍專化型生理小種1# ;58 :枯萎病菌甘藍專化型生理小種2# ; Botrytis cinerea :灰霉菌；T30-4 :葉霉菌；Rhizoctonia :絲核菌；Pythium :腐霉菌； Colletotrichum :炭疽菌；ddH20 :清水對照；
[0029] 圖5、不同退火條件下Fom引物的擴增電泳圖；
[0030] 圖中，M :Trans 3k maker，其條帶從上往下依次對應 3kb，2kb，lkb，750bp，500bp， 250bp，IOObp ; 1-11 分別為 PCR 退火溫度 65 °C，62 °C，60 °C，58 °C，57 °C，56 °C，55 °C，54 °C， 52°C，5(TC，48°C。
【具體實施方式】
[0031] 下面結合實施例進一步說明本
【發明內容】
，需要說明的是，在沒有特殊說明的情況 下，本