一種通過微生物轉化來制備4-雄烯二酮的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種通過微生物轉化來制備4-雄烯二酮的方法，尤其涉及4-雄烯二 酮制備過程中的串罐發酵技術，即在利用分支桿菌選擇性降解植物留醇制備4-雄烯二酮 的過程中通過串罐發酵技術用微生物三個生長階段持續降解植物留醇高產4-雄烯二酮的 發酵工藝，屬于發酵技術領域。
【背景技術】
[0002] 4_雄烯二酮(化學名稱：雄留_4_烯_3,17-二酮，英文名4-Androstenedione，簡 稱AD)，該產品外觀形狀呈近白色晶體粉末，無異味，無毒性，不溶于水，是一種當今世界上 用途極廣，科技含量高的生物化工中間體。
[0003] 雄烯二酮是生產激素類原料藥的重要中間體，可以說幾乎所有留體激素藥物都可 以以雄烯二酮為起始原料進行生產，如用于生產皮質激素、性激素、孕激素及蛋白同化激 素，又可用于合成可的松、強的松、黃體酮、雌烯醇、地塞米松等100余種藥物，也是用于生 產抗早孕米非司酮和各類計劃生育用藥必不可少的原料。
[0004] 發酵法生產4-雄烯二酮是1998年在美國一家制藥公司開始，它以原料來源廣、原 料成本低、反應專一性強、反應條件溫和、生產步驟簡化和生產周期短等優點逐漸取代了傳 統的化學合成法，在國內外受到了普遍的重視。
[0005] 在微生物轉化法生產4-雄烯二酮的過程中，4-雄烯二酮的產品收率通過提取、精 制技術的一系列改進進一步提升的空間非常有限，所以目前降低4-雄烯二酮生產成本的 潛力在發酵技術的改進方面。如何最大限度地提高微生物對植物留醇的轉化率是每個生產 企業研究的重點。目前，微生物轉化法生產4-雄烯二酮都采用單純的間歇式分批培養發 酵，種子培養需要采用逐級擴大培養的方法，即從斜面到種子罐，經過一級和二級種子罐逐 級擴大培養后，轉入發酵罐。種子液進入發酵罐后還要經過對環境的適應期、自身對數生 長期最后再進入次級代謝期產生目的產物。這種逐級培養方式使得種子液在發酵罐內較長 時間只是進行了自身初級代謝，一般在35~45h才開始進行合成目的產物的次級代謝，并且 4_雄烯二酮轉化菌種還沒有對植物留醇轉化完就會進入菌體代謝衰退期，這樣就會延長發 酵罐培養周期，增加動力成本，對植物留醇的轉化率一般只能維持在459Γ65%，造成生產的 不穩定。
【發明內容】
[0006] 本發明所解決的技術問題是打破微生物生長代謝三階段的規律，確保了 4-雄烯 二酮的制備時間出現在微生物生長代謝的適應期，縮短了整個發酵周期。
[0007] 微生物轉化法是指某種微生物對有機物某一特定部位或基團作用使它轉變成結 構上相似的另一種化合物的過程。微生物轉化與一般的氨基酸和抗生素發酵不同，轉化產 物不是微生物的代謝產物，而是利用微生物所產生的酶對底物的某一部位進行特定的生物 化學反應來獲得的特定產物。留體類物質一般不是微生物代謝途徑中起生理作用的物質， 因此，留體類物質不像其他營養物質一樣，會被微生物最終分解為二氧化碳和水。
[0008] 微生物轉化植物留醇的過程可用以下通式表示： 進入 分泌 底物一一一一一一菌體細胞一一一一一一反應產物(胞內或胞外） 4_雄烯二酮的發酵轉化過程通常分兩個階段進行，第一階段是菌體的自身生長階段， 該時期供給菌體豐富的營養，在最適溫度、PH和通氣條件下進行培養，以得到足夠的菌體和 大量高活性的轉化酶；第二階段是對植物留醇進行定向轉化的階段。研究證明這兩個階段 有一個共同特點：菌體的最適自身生長階段的pH范圍與菌體對植物甾醇轉化的最適pH范 圍基本相同，這也是本發明取得成功的關鍵所在。
[0009] 串罐發酵即每個發酵罐的種子液全部來自前一個發酵罐的發酵液。一般取生長旺 盛，剛進入轉化期的發酵液。時間：取發酵液培養至20-30小時發酵液作為種子最佳，判斷 標準為發酵液的PH降至6. 8左右，發酵單位小于0. 5g/l，鏡檢無雜菌。這樣每一個發酵罐 的種子液來自發酵罐中剛進入轉化期的種子液，依次類推，進行串罐發酵培養。
[0010] 本發明中一種通過微生物轉化來制備4-雄烯二酮的方法，即4-雄烯二酮制備過 程中的串罐發酵工藝，其包括以下步驟： 1)種子制備階段 其中，所采用的菌株為恥垢分支桿菌(Mycobacterium smegmatis) :X --級種子罐培養基的配方為：葡萄糖：〇. 2~0. 5%、硝酸銨：0. 2~0. 5%、硫酸鎂： 0. Of 0. 05%、磷酸氫二鉀0. Of 0. 05%、酵母浸粉：1. (Γ2. 2%，加水定容后調pH至7. 0。
[0011] 一級種子罐培養控制參數：接種量：8~10%，罐溫：28~30 °C，通氣比： 1:0. 2?I. Ovvm，罐壓：0· 03?0· 05Mpa，轉速：20(T300rpm，周期：30?48 小時。
[0012] 2二級種子罐培養基配方為：葡萄糖：0. 2、. 5%、硝酸銨：0. 2、. 5%、硫酸鎂： 0. Of 0. 05%、磷酸氫二鉀0. Of 0. 05%、酵母浸粉：1. (Γ2. 2%，加水定容后調pH至7. 0。
[0013] 二級種子罐的控制參數為：接種量：1(Γ15%，罐溫：28~30 °C，通氣比： 1:0. 2?I. Ovvm，罐壓：0· 03?0· 05Mpa，轉速：20(T300rpm，周期：20?30 小時。
[0014] 2)發酵半串罐培養 發酵罐培養基配方為：葡萄糖：1. (Γ5. 〇%、酵母浸粉：〇. 5~2. 5%、硝酸銨：0. 15~0. 55%、 硫酸鎂：〇· 02?0· 2%、磷酸氫二鉀：0· 1?L 0%、硫酸亞鐵：0· 001?0· 01%、碳酸鈣：0· 1?0· 5%、植 物甾醇：1 ?4%、乳化劑：0· 001 ?05 (v/v) %、消泡劑：0· 03% (v/v)。
[0015] 發酵罐的控制參數為：接種量：8?10%，罐溫：28?30°C，通氣比：1:0.2?1.(^_，罐 壓：0· 03?0· 05Mpa，轉速：15(T260rpm，用10%濃度氨水溶液控制pH在6. 6?7. 0,用20%濃度 的硝酸銨溶液控制發酵液中氨氮含量為50-70mg/100ml。取發酵液培養至20-30小時小部 分發酵液作為種子最佳，判斷標準為發酵液的PH降至6. 8左右，發酵單位小于0. 5g/l，鏡檢 無雜菌。每一個發酵罐的種子液來自上一個發酵罐中剛進入轉化期的種子液，依次類推，進 行串罐發酵培養。發酵罐培養周期為88~108h。
[0016] 取種時間的選擇：按照傳統的間歇式發酵理論，隨著種子液在發酵罐培養時間的 延長，種子首先進入對環境適應期，再進入對數生長期，培養周期大約在20-30小時時菌體 量和轉化酶活性基本上達到最大，因此取發酵培養20-30小時發酵液作為部分種子最佳。 判斷標準：發酵液的PH降至6. 8左右，發酵單位小于0. 5g/l，鏡檢無雜菌。
[0017] 3 )發酵液有效成分HPLC檢測 色譜條件：色譜柱：Kromasil C18 5Mm 200X4. 6mm，流動相：CH30H:H20 = 80 :20 (v/v)，流速：1. 〇ml/min，檢測波長：242nm。
[0018] 標準曲線的測定： 配制一系列不同濃度的AD標準溶液（50-500μ8/πι1)，分別取各濃度標準溶液的過濾液 2〇μ1注入高效液相色譜儀中，測定其吸收峰面積，然后對濃度（Y)和吸收峰面積（X)進行一 元線性回歸，得到一元線性回歸方程。
[0019] 效價計算方法： 將待測樣品制成合適濃度（50-50(^g/ml)的甲醇溶液，用0.45Mm的微孔濾膜過濾，準 確吸取濾液2〇μ1注入HPLC中，記錄色譜圖，將AD峰面積代入上述的回歸方程中，計算得到 樣品中AD量。
[0020] 4)植物留醇轉化率的計算 發酵完成后，發酵液經甲醇處理后，再用液相色譜定量測出雄烯二酮的含量，然后計算 植物留醇的轉化率：轉化率/%=發酵液中AD含量*100/ (投料油中留醇含量*0. 66*0. 95)。
[0021] 本發明的優點： 1、 通過本方法使得分支桿菌對植物留醇的轉化率與完全用逐級擴大培養成熟的種子 液作為發酵罐的種子相比其轉化率提高20%以上；與完全用前一個發酵罐的發酵液作為下 一個發酵罐的種子相比其轉化率提高15%以上； 2、 該發酵工藝為單相水工藝，通過選用合適的乳化劑很好地解決了留醇在水中溶解度 差的問題，為后續提取解決了一系列難題，使得4-雄烯二酮的質量更加穩定。
[0022] 3、運用該工藝消除了由于種子質量波動引起的發酵產量的波動，穩定了發酵生 產； 4、運用該工藝使得發酵周期由原來的160?170小時縮短為現在的80?108小時，縮 短了罐批運轉周期，增加進罐批次，提高了設備利用率，降低了生產成本，可獲得更大的經 濟效益。
【具體實施方式】
[0023] 下面通過具體實施例進一步說明本發明的技術方案，同時增加對照試驗，但是本 發明不以具體實施例為限。
[0024] 1、制備材料與方法 1. 1材料 1. 1. 1菌種 菌種來源：DY20120806-102 (山東東藥藥業股份有限公司） I. 1. 2儀器與分析條件 HPLC :安捷倫-1260,色譜條件：色譜柱---Kromasil C18 5Mm 200 X 4. 6mm 流動相 CH3OH = H2O = 80 :20 (v/v)，流速---1. Oml/min，檢測波長---242nm。試 齊IJ :雄留-4-烯-3, 17-二酮（AD)標準品和甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。含量用外標 峰面積法計算。
[0025] 1. 2對照試驗一(傳統的間歇式發酵） I. 2. 1培養基及培養工藝 1.2. 1.1種子制備階段 2 -級種子罐培養基的配方為：葡萄糖：〇. 2、. 5%、硝酸銨：0. 2、. 5%、硫酸鎂： 0. Of 0. 05%、磷酸氫二鉀0. Of 0. 05%、酵母浸粉：1. (Γ2. 2%，加水定容后調pH至7. 0。
[0026] 一級種子罐培養控制參數：接種量：8~10%，罐溫：28~30 °C，通氣比： 1:0. 2?I. Ovvm，罐壓：0· 03?0· 05Mpa，轉速：20(T300rpm，周期：30?48 小時。
[0027] :S.二級種子罐培養基配方為：葡萄糖：2、. 5%、硝酸銨：0. 2、. 5%、硫酸鎂： 0. Of 0. 05