一種利用腸膜明串珠菌生產低聚葡萄糖的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物領域及生物工程領域。
【背景技術】
[0002]低聚糖通常被認為是一類由糖苷鍵連接，由2?10個單糖單位組成的短鏈糖類聚合物。帶有分枝結構的低聚糖能夠抵御腸道內多種消化酶的降解，從而在不被人體消化和吸收的情況下經過上消化道進入大腸，選擇性的刺激腸道內有益微生物的生長和繁殖，這種低聚糖稱之為非消化性低聚糖(non-digestible oligosaccharide)或功能性低聚糖,它是益生素產品的一個重要來源。另外，低聚糖可以被雙歧桿菌和乳酸桿菌代謝利用，而不能被大腸桿菌降解，因此對腸道微生物菌群具有顯著的整腸調節作用。正因為如此顯著的益生效果，低聚糖被廣泛的應用于功能性食品的生產，在改善人體消化道內的微生態平衡、消除便秘、緩解腹瀉和防止結腸癌等方面表現出良好的促進作用。
[0003]腸膜明串珠菌除了能夠利用蔗糖合成大分子葡聚糖之外，還能夠以某些特定的二糖、三糖或其他小分子糖類化合物作為受體，利用葡聚糖蔗糖酶的轉糖苷作用將蔗糖分子中的葡萄糖苷基轉移至受體分子上形成不同聚合度的低聚葡萄糖。
[0004]目前國內的低聚糖生產主要通過淀粉的水解的方法制得。但是傳統的酶解方法制備的功能性低聚糖產物中通常含有大量的單糖、二糖或者是麥芽糊精，它們都屬于能夠被人體消化吸收的碳水化合物，不僅不能選擇性的刺激腸道有益微生物的生長和活力，而且還增加了食物產品的熱能值，因此在很大程度上降低了功能性低聚糖的有效率。大多數低聚葡萄糖可以采用酶解的方法直接獲得，但酶解方法并不適用于這種低聚糖的大規模生產，特別是想要以較低的生產成本來獲得能夠作為食品添加劑的低聚糖產品。
【發明內容】
[0005]本發明目的是采用生物發酵的方法合成功能性低聚糖，旨在建立以明串珠菌發酵法生產功能性低聚糖的具體工藝。此方法能夠提高發酵速率、低聚葡萄糖的產量及功能性低聚糖的純度。
[0006]本發明的一種利用腸膜明串珠菌生產低聚葡萄糖的方法，它是按照以下步驟進行的:
[0007]—、按2%的接種量將腸膜明串珠菌接種于低聚糖生成培養基中，置于28°C條件下以100r/min的轉速震蕩培養48h ;其中，培養過程中低聚糖生成培養基的pH值保持在6.5 ；
[0008]二、將步驟一培養后的培養液進行離子交換柱層析，首先將培養液過陽離子交換柱，再過陰離子交換柱，在柱層析流出液的糖度升高的時刻開始收集流出液，在糖度下降為零的時刻停止收集流出液；
[0009]三、采用真空蒸發的方法將步驟二收集的流出液濃縮，然后在0°C溫度下靜置24h，再在冷凍條件下離心取上清液，即得低聚糖濃縮液；
[0010]四、將活化好的釀酒酵母以2%的接種量接種于YEro培養基中，在30°C條件下以100r/min的轉速震蕩培養18h ;然后將培養后的培養液在8000g轉速下冷凍離心20min，棄上清液收集固相物，將固相物用滅菌的蒸餾水懸浮，并按2%的比例接種到步驟三得到的低聚糖濃縮液中，然后置于30°C的搖床中以100r/min的轉速震蕩培養24h ；
[0011]五、將步驟四培養后的發酵液經真空減壓干燥后，即得低聚糖純化產物；
[0012]其中，步驟二中的離子交換柱層析的樹脂預處理過程為:將陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂分別用蒸餾水清洗至水澄清，然后將陽離子交換樹脂先用質量百分含量為2%?4%的NaOH溶液浸泡2h?4h，再用蒸餾水洗至pH為中性，再用質量百分含量為2%?4%的稀鹽酸浸泡4h?8h后，再用蒸餾水洗至pH為中性；
[0013]陰離子交換樹脂先用質量百分含量為2 %?4 %的稀鹽酸浸泡4h?8h后，用蒸餾水洗至PH為中性，再用質量百分含量為2%?4%的NaOH溶液浸泡2h?4h，再用蒸餾水洗至PH為中性；
[0014]重復離子交換柱層析的樹脂預處理過程3次，最后用蒸餾水將陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂洗至PH為中性，即完成對離子交換柱層析的樹脂預處理。
[0015]本發明的腸膜明串珠菌購自CCICC，編號為22177 ;釀酒酵母購自北京林業大學，編號為 BJFU 9.0017。
[0016]本發明包含以下有益效果:
[0017]本發明建立了以離子交換除鹽、冷凍結晶除甘露醇及酵母選擇性發酵的低聚糖純化三步驟工藝，得到低聚葡萄糖的純度達到90%以上。
[0018]本發明的MS培養基配方下培養腸膜明串珠菌48h后，細胞生物量能達到1.50?1.70g/L左右，低聚糖產量達到60?70g/L。
[0019]本發明通過加入大豆蛋白胨和酶解酪蛋白能促使腸膜明串珠菌獲得較高的細胞生物量，細胞生物量能達到1.50?1.70g/L左右。
[0020]本發明通過添加CaCO3至培養基中，腸膜明串珠菌發酵生成的乳酸被CaCO 3中和，使發酵液的PH值控制在相對較高的范圍，消除乳酸對細胞產生的產物抑制作用，從而使細胞更為良好的生長和繁殖。添加CaCO3的培養基中獲得的細胞生物量比沒有添加CaCO 3的情況高出0.11?0.13g/L。
[0021]本發明的腸膜明串珠菌在有氧氣存在的條件下能夠獲得更快的生長速度和更高的細胞生物量。有氧培養時菌株進入細胞生長對數期的時間提前2h，獲得的細胞生物量達到 1.68-1.75g/L。
[0022]本發明采用冷凍結晶法對甘露醇的清除率可達65?79%。
【附圖說明】
[0023]圖1為釀酒酵母發酵除去果糖、麥芽糖和潘糖的效果圖；其中，A為低聚糖(DP>3)的變化曲線為果糖的變化曲線；C為潘糖的變化曲線；D為麥芽糖變化曲線；
[0024]圖2為采用實施例方法得到低聚葡萄糖的高效液相色譜圖。
[0025]圖3為利用腸膜明串珠菌生產低聚葡萄糖的工藝流程圖；
[0026]圖4為本發明的離子交換裝置示意圖。
【具體實施方式】
[0027]【具體實施方式】一:本實施方式的一種利用腸膜明串珠菌生產低聚葡萄糖的方法，它是按照以下步驟進行的:
[0028]一、按2%的接種量將腸膜明串珠菌接種于低聚糖生成培養基中，置于28°C條件下以100r/min的轉速震蕩培養48h ;其中，培養過程中低聚糖生成培養基的pH值保持在6.5 ；
[0029]二、將步驟一培養后的培養液進行離子交換柱層析，首先將培養液過陽離子交換柱，再過陰離子交換柱，在柱層析流出液的糖度升高的時刻開始收集流出液，在糖度下降為零的時刻停止收集流出液；
[0030]三、采用真空蒸發的方法將步驟二收集的流出液濃縮，然后在0°C溫度下靜置24h，再在冷凍條件下離心取上清液，即得低聚糖濃縮液；
[0031]四、將活化好的釀酒酵母以2%的接種量接種于YEro培養基中，在30°C條件下以100r/min的轉速震蕩培養18h ;然后將培養后的培養液在8000g轉速下冷凍離心20min，棄上清液收集固相物，將固相物用滅菌的蒸餾水懸浮，并按2%的比例接種到步驟三得到的低聚糖濃縮液中，然后置于30°C的搖床中以100r/min的轉速震蕩培養24h ；
[0032]五、將步驟四培養后的發酵液經真空減壓干燥后，即得低聚糖純化產物；
[0033]其中，步驟二中的離子交換柱層析的樹脂預處理過程為:將陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂分別用蒸餾水清洗至水澄清，然后將陽離子交換樹脂先用質量百分含量為2%?4%的NaOH溶液浸泡2h?4h，再用蒸餾水洗至pH為中性，再用質量百分含量為2%?4%的稀鹽酸浸泡4h?8h后，再用蒸餾水洗至pH為中性；
[0034]陰離子交換樹脂先用質量百分含量為2 %?4 %的稀鹽酸浸泡4h?8h后，用蒸餾水洗至PH為中性，再用質量百分含量為2%?4%的NaOH溶液浸泡2h?4h，再用蒸餾水洗至PH為中性；
[0035]重復離子交換柱層析的樹脂預處理過程3次，最后用蒸餾水將陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂洗至PH為中性，即完成對離子交換柱層析的樹脂預處理。
[0036]本實施方式步驟二中的流出液糖度測定是在有流出液流出后，每隔1min采用阿貝折光儀檢測流出液體的糖度。
[0037]本實施方式步驟一的振蕩培養其目的在于使培養過程中培養基中含氧量增加，促進菌株的生長以及提高低聚糖的產量。
[0038]本實施方式步驟三中的冷凍靜置是為了使甘露醇結晶析出。
[0039]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟一中的低聚糖生成培養基為MS培養基，IL的MS培養基配方為:100g的蔗糖、50g麥芽糖、5g的酵母浸出物、5g 的大豆蛋白胨、0.0lg 的 FeSO4.7H20、0.2g 的 MgSO4.7Η20、0.0lg 的 MnSO4.H20、3g 的Κ2ΗΡ04、0.05g的CaCl2、0.0lg的NaCl和5mL的Tween 80。其它與【具體實施方式】一相同。
[0040]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:MS培養基配制過程為:首先將未添加蔗糖和麥芽糖的培養基PH調至7.2，然后進行高壓滅菌，向其加入高壓滅菌后的蔗糖溶液和麥芽糖溶液，使蔗糖在培養基中的終濃度為100g/L的和麥芽糖終濃度為50g/L的，即得MS培養基。其它與【具體實施方式】一相同。
[0041]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟二中進行離子交換柱層析具體過程為:將預處理后的陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂，灌入ct5CmX30Cm的玻璃層析柱，按陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂與培養液的體積比為:1:1:0.4的比例，首先將培養液過陽離子交換柱，再過陰離子交換柱進行離子交換柱層析。其它與【具體實施方式】一相同。
[0042]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:陽離子交換樹脂為732型強酸性陽離子交換樹脂；陰離子交換樹脂為717型強堿性陰離子交換樹脂。其它與【具體實施方式】一相同。
[0043]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟四中的IL的YEH)培養基配方含有:10g酵母浸出物、20g蛋白胨和20g