吸附固定透性化乳酸菌轉化菜油腳料生產共軛亞油酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農產品廢棄物利用技術領域。
【背景技術】
[0002]共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是一種主要從反合動物脂肪和牛奶產品中發現的天然活性物質，是一類含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸(亞油酸)異構體混合物，特別是c-9，t-11 CLA和t-10，c-12 CLA，被認為最具有生物活性，其中c_9，t_ll CLA是唯一能被動物細胞吸收進入磷脂層的共軛亞油酸異構體，而t-10，c-12 CLA在抗癌、抗粥脈動樣硬化、調節免疫功能方面有重要作用。目前通常采用葵花籽油、紅花籽油等價格昂貴的原料為底物生產共軛亞油酸。菜油是我國主要食用油之一，總產量占植物油總產量的1/3以上，其所產生的副產物一一菜油腳料價廉易得，而且含有20%左右的亞油酸，采用菜油腳料作為生成CLA的底物，不僅節約成本，還可以解決菜油腳料帶來的環境污染問題。
[0003]乳酸菌所產的亞油酸異構酶可以實現生物合成法轉化亞油酸生成CLA。傳統生物發酵法具有細胞很難達到高密度，生長周期長，轉化率低，易染菌，產物復雜，難于分離提取，菌體無法重復利用等問題。乳酸菌透性化處理可以增強細胞壁和細胞膜的通透性，減弱細胞壁對細胞膜上異構酶的屏蔽作用，使亞油酸異構酶與亞油酸更易結合，提高CLA產量。采用吸附固定化透性乳酸菌直接生物轉化則具有轉化周期短，轉化介質液配制方便，反應體系中干擾物質少，不易染菌，產物較單一，細胞密度高，菌體可以重復利用，產物容易分離等優點，從而達到高效率，低成本的生產目的。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供了一種利用廢棄的陶瓷作為載體吸附固定透性化乳酸菌，實現農產品廢棄物菜油腳料高效轉化生產共軛亞油酸(CLA)的方法。
[0005]本發明是通過以下技術方案實現的。
[0006]本發明包括如下步驟。
[0007](I)吸附固定載體的預處理:將廢棄陶瓷敲碎，得到直徑為4-6 mm的多孔陶瓷顆粒，清水沖洗后，先用0.1 mo I/L HCl溶液浸泡24-48 }1，再用0.1 mo I/L NaOH溶液浸泡24-48 h，最后用水洗至中性，烘干，滅菌，得到無菌吸附固定多孔陶瓷載體。
[0008](2)制備透性化乳酸菌:從新鮮斜面培養基上挑取1-3環乳酸菌，接種到50-200mL MRS培養基中，35-37°C厭氧培養20-26 h，即為乳酸菌菌懸液，取菌懸液繼續在MRS培養基中擴大培養。將菌懸液4°C離心收集菌體細胞，將菌體細胞置于_20°C下冷凍后取出，在室溫下融化，反復凍融2-4次，即得透性化乳酸菌。
[0009](3)吸附固定透性化乳酸菌:將步驟(2)的透性化乳酸菌加入含步驟(I)的無菌吸附固定多孔陶瓷載體的反應管中，然后加入無菌生理鹽水浸沒載體，再加入0.02%-0.05%的硫酸鋁鉀和0.3% -0.6%的淀粉，透性化乳酸菌細胞濃度達到0.3-0.6 g/mL，4°C條件下吸附固定30-120 min后，4°C離心去上清，即得吸附固定透性化乳酸菌。
[0010](4 )菜油腳料的乳化、酶解處理:將菜油腳料、Tween 80、Span-80按照1:(0.4-0.9): (0.2-0.6)比例混合，45-80°C水浴5_15min，再加入適量去離子水至菜油腳料終濃度為80-100 mg/mL，用混合器混合均勻，110_121°C滅菌20-30 min,即為菜油腳料乳化液；取菜油腳料乳化液，加入PH值8.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，添加爪哇毛霉脂肪酶粉至終濃度為200-350 U/mL，40-60°C，120-150 rpm酶解30-50 min，即得菜油腳料的乳化、酶解液。
[0011](5)吸附固定透性化乳酸菌轉化菜油腳料乳化、酶解液:將步驟(4)的菜油腳料的乳化、酶解液和pH為6.0-6.8的0.1 mo I/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液加入步驟(3)的含吸附固定透性化乳酸菌的反應管，使得菜油腳料終濃度為60-80 mg/mL，35-38°C轉化19-22h，離心分離后，上清液為轉化液，用正己烷將轉化液中的共軛亞油酸萃取。吸附固定透性化乳酸菌可重復利用。
[0012]本發明可實現農產品廢棄物菜油腳料和廢棄陶瓷的資源化利用，具有原料成本低，轉化細胞密度高，轉化效率高(轉化率可達40% -60%,較游離的透性化乳酸菌轉化高20%左右)，轉化過程不易染菌，干擾物質少，產物易分離，菌體可以重復利用等優點。
【附圖說明】
[0013]圖1為本發明實施例1中多孔陶瓷表面吸附固定嗜酸乳桿菌的掃描電鏡圖片。
【具體實施方式】
[0014]下面通過實施例并結合附圖對本發明作詳細說明。
[0015]實施例1。
[0016](I)吸附固定載體的預處理:將廢棄陶瓷敲碎，得到直徑為4-6 mm的多孔陶瓷顆粒，清水沖洗后，先用0.1 mo I/L HCl溶液浸泡24 h，再用0.1 mo I/L NaOH溶液浸泡24 h，最后用水洗至中性，烘干，滅菌，得到無菌吸附固定多孔陶瓷載體。
[0017](2)制備透性化乳酸菌:從新鮮斜面培養基上挑取3環嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854，接種到150 mL MRS培養基中，37°C厭氧培養20 h，即為乳酸菌菌懸液，取菌懸液繼續在MRS培養基中擴大培養。將菌懸液4°C，5000 rpm離心20 min，去除上清液，將菌體細胞置于_20°C下冷凍后取出，在室溫下融化，反復凍融2次，即得透性化乳酸菌。
[0018](3)吸附固定透性化乳酸菌:將步驟(2)的透性化乳酸菌加入含步驟(I)的無菌吸附固定多孔陶瓷載體的反應管中，然后加入無菌生理鹽水浸沒載體，再加入0.03%的硫酸鋁鉀和0.5%的淀粉，透性化乳酸菌細胞濃度達到0.4 g/mL,放入4°C冰箱吸附固定60 min后，4000 rpm，4°C離心10 min，去除上清液，即得吸附固定透性化乳酸菌，多孔陶瓷表面吸附固定嗜酸乳桿菌的掃描電鏡圖片見附圖1。
[0019](4)菜油腳料的乳化、酶解處理:將菜油腳料、Tween 80、Span-80按照1:0.8:0.4比例混合，60°C水浴5 min，再加入適量去離子水至菜油腳料終濃度為80 mg/mL，用混合器混合均勻，121°C滅菌30 min,即為菜油腳料乳化液；取菜油腳料乳化液，加入pH值8.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，添加爪哇毛霉