一對特異識別豬H11位點的sgRNA及其編碼DNA和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及兩條特異識別豬Hll位點的sgRNA及其 編碼DNA和應用。
【背景技術】
[0002] 2010年，斯坦福大學的Simon Hippenmeyer及其研宄團隊在小鼠的第11號染色體 上分離并鑒定出了一個良好的基因插入位點，命名為hippll位點，簡稱Hll位點。Hll位點 位于Eif4enifl與Drgl兩個基因的間隙，與Eif4enifl基因的19號外顯子和Drgl基因的 9號外顯子相鄰，大小約5kb。Hll位點由于位于兩個基因之間，因此安全性較高，無基因沉 默效應，具有廣譜的細胞表達活性。實驗證實Hippll位點定點基因修飾的小鼠與野生型小 鼠生長發育無區別。目前類似的還有R〇s26位點，但是該位點為一個基因，其啟動子為全身 性廣譜表達，難以做到組織特異性表達，然而Hll位點則不存在類似的困難，由于其位于兩 基因之間，并且不存在啟動子，所以可以選擇實驗所需的啟動子完成目的基因的時空特異 性表達，更好的達到任務目標。如果在豬的基因組中定位hippll這樣安全有效的基因修飾 位點，將有利于穩定轉基因豬培育的技術體系。
[0003] ZFN和TALEN打靶技術是目前研宄較為成熟的兩種定點突變技術，但是這兩種技 術構建程序較為繁瑣，每一個位點需要構建一對相應的核酸酶，而CRISPR/Cas9系統對特 異位點的識別靠小的crRNA的引導，CRISPR區可以有一系列的crRNA組成，每個針對特異 位點的crRNA只有幾十個堿基，整個載體較小，相對于ZFN和TALEN載體，更加容易構建。
[0004] (CRISPR) /CRISPR-associated (Cas)是細菌和古細菌一種不斷進化適應的免疫防 御機制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA來識別并剪切DNA以降解外來核酸分子。Cong等及 Mali等證明Cas9系統能在293T、K562、iPS等多種細胞中，進行有效的靶向酶切，非同源重 組（NHEJ)、同源重組（HR)效率在3-25%之間，與TALEN酶切效果相當。他們還證明，多個 靶點可以同時進行靶向酶切。但是，隨后的研宄表明，Cas9存在較為明顯的脫靶效應，麻 省理工學院Feng Zhang團隊使用雙切刻技術將Cas9的特異性提高了 50倍以上（Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9for enhanced genome editing specificity. Cell. Ran et al，2013)，維護了 Cas9在基因打靶技術領域的地位。借助于這一技術，動植物基因 功能研宄及育種等等都將得到迅猛的發展。
【發明內容】
[0005] 本發明針對豬的Hll位點設計了一對特異性識別豬Hll位點的SgRNA，本發明還提 供了其相應的編碼DNA和應用。本發明是利用編碼這對sgRNA部分序列的短片段DNA構建 表達載體，該表達載體能夠表達出這對sgRNA，這對sgRNA能夠特異性地識別豬Hll位點。 本發明還利用這對sgRNA引導Cas9n核酸酶（即Cas9切刻酶）對豬Hll位點進行準確、高 效地靶向修飾。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0007] 一對特異識別豬Hl 1位點基因的sgRNA，由sgRNA-L和sgRNA-R組成；sgRNA-L和 SgRNA-R分別由101個核苷酸組成，其中5'末端20nt的RNA片段（分別命名為sgRNA-L20 和sgRNA-R20)可以識別染色體上特定的DNA序列，其余81nt稱為骨架RNA片段。骨架RNA 片段可形成發夾結構，與Cas9n核酸酶結合，從而引導Cas9n核酸酶切割靶標DNA單鏈，兩 個單鏈切口導致雙鏈斷裂（DSB)，細胞利用自身修復功能，使得靶標位點附近的序列發生變 化；另外，這對sgRNA識別的DNA靶序列呈"頭對頭"的排布方式（即二者的5'末端相互靠 近），二者相距4bp，即有4bp的間隔。
[0008] SgRNA-L的識別染色體上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下1)或2):
[0009] 1)序列表中的序列1所示的核苷酸序列；
[0010] 2)將所述1)的核苷酸序列經過一個或幾個堿基的取代和/或缺失和/或添加且 具有與1)中的核苷酸序列具有同樣功能的核苷酸序列；
[0011] sgRNA-R的識別染色體上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下3)或4):
[0012] 3)序列表中的序列2所示的核苷酸序列；
[0013] 4)將所述3)的核苷酸序列經過一個或幾個堿基的取代和/或缺失和/或添加且 具有與3)中的核苷酸序列具有同樣功能的核苷酸序列；
[0014] 本發明還提供了編碼上述特異識別豬Hl 1位點的SgRNA的DNA分子。
[0015] 上述的DNA分子由編碼sgRNA-L的DNA分子和編碼sgRNA-R的DNA分子組成。
[0016] 進一步的，上述的DNA分子由編碼sgRNA-L的DNA分子甲和編碼sgRNA-R的DNA 分子乙組成。
[0017] 其中，上述DNA分子甲的核苷酸序列由序列表中的序列3所示。
[0018] 其中，上述DNA分子乙的核苷酸序列如序列表中的序列4所示。
[0019] 本發明的另一個目的是提供該對SgRNA在特異識別和靶向修飾豬Hl 1基因中的應 用。所述的豬Hll基因，其核苷酸序列是如序列表中的序列5所示。
[0020] 本發明的再一個目的是該對特異SgRNA在構建豬Hll基因突變庫中的應用。所述 的豬Hll基因，其核苷酸序列如序列表中的序列5所示。
[0021] 本發明提供的一對特異識別豬Hll基因的SgRNA，特異性強，能有效減少CRISPR/ Cas9系統存在的脫靶現象，能大大增加外源基因定點插入的效率，進而減少非特異性切割 所引起的基因組非靶向位點的突變帶來的影響。且本發明提供的一對該sgRNA的編碼DNA 片段，能通過Cas9系統在細胞或個體水平上對豬Hll基因進行敲除或修飾，以解析豬Hlll 基因的功能、構建豬Hll基因突變庫，為培育優良品系的豬提供前期技術支持，為轉基因豬 的制備提供了穩定的平臺。
【附圖說明】
[0022] 圖1為凝膠電泳檢測分析酶切載體結果圖。
【具體實施方式】
[0023] 以下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本 發明精神和實質的前提下，對本發明所作的修飾或者替換，均屬于本發明的范疇。
[0024] 實施例I sgRNA表達質粒對的構建
[0025] UsgRNA靶點設計
[0026] 根據小鼠的Hll位點，找到豬的Eif4與Drg基因（小鼠的位點位于該兩基因中 間），在NCBI中調出中間區域找出豬Hll位點，其核苷酸序列如序列表中的序列5所示，
[0027] 根據PAM序列選擇用于基因敲除的SgRNA靶點，PAM序列為NGG :
[0028] SgRNA-L 靶位點位置 1 (命名為 Hll-sgL2):
[0029] AGATCAGGGTGGGCAGCTCTGGG
[0030] 相對應的SgRNA-L序列中識別該靶點的核苷酸序列如序列表中的序列1所示；編 碼該上述序列的DNA序列如序列表中的序列3所示。
[0031] SgRNA-R