一種用于預防和治療人乳頭瘤病毒感染和宮頸癌的微小rna的制作方法
【專利說明】一種用于預防和治療人乳頭瘤病毒感染和宮頸癌的微小
RNA
技術領域
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[0001]本發明屬于生物醫學技術領域，涉及一種用于預防和治療人乳頭瘤毒感染以及人宮頸癌的微小RNA。
技術背景:
[0002]宮頸癌是全球范圍內最常見的女性生殖道惡性腫瘤。據統計，全世界每年大約有將近50萬的宮頸癌新發病例，超過27萬婦女死于該病。近年來其發病率不斷上升且出現年輕化趨勢，死亡率也有回升的趨勢。因此，研發新的安全有效的治療靶點刻不容緩。
[0003]人乳頭瘤病毒(humanpapilloma virus,HPV)是一種無包膜雙鏈環狀DNA病毒,其基因組全長約7200-8000bp，編碼6個早期蛋白(El，E2, E4, E5, E6, E7)和兩個晚期蛋白(LI和L2)。根據致癌危險性，分為高危型HPV和低危型HPV，前者與宮頸癌及重度癌前病變相關，后者則弓I起生殖道疣等良性病變。現已明確，高危型HPV感染是導致宮頸癌的直接病因和首要病因。國內外經過長期、大規模的臨床流行病學調查發現，超過99%的宮頸癌樣本存在HPV病毒感染，其中，HPV16為主要感染型別。HPV病毒感染宮頸組織后，通常要經過一個較為長期、緩慢的過程，一般為十余年甚至數十年，組織才會出現癌變。因此，在這個長期持續的HPV感染過程中，尋找抗HPV感染及其病毒癌基因的靶點，可以阻斷HPV持續感染以及組織癌變，是預防和治療宮頸癌的關鍵。
[0004]微小RNA (microRNA,miRNA)是一類長約19?25nt的單鏈小分子非編碼RNA,通常與靶基因的3 ‘非翻譯區結合，有時也可與5 ‘非翻譯區或編碼區結合，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而在轉錄后水平負向調控基因表達。miRNA廣泛存在于從植物、線蟲到人類的細胞中，參與調控一系列的生命活動。截止目前，miRBase數據庫中收錄各物種中已發現的成熟miRNA共達21264個，其中在人類中發現并已經得到實驗證實的有2042個(Releasel9:August2012)。近年的研究顯示miRNA與多種惡性腫瘤密切相關,其可充當癌基因或抑癌基因的角色，在腫瘤血管生成、腫瘤細胞的增殖、凋亡、浸潤及轉移等過程中發揮重要作用。
[0005]近年來，越來越多的證據顯示miRNA具有直接抗病毒作用。從2005年至今，有多條人類細胞miRNA被報道可直接靶向攻擊外源性致病病毒，調控病毒基因的表達，如:miR-196、miR-448 抗 HCV 病毒;miR_199a、miR-210、miR_125a 抗 HBV 病毒；以及一系列miRNAs抗HIV、H5N1、HlNl病毒等。這種作用模式被證實在機體抗病毒感染免疫中發揮重要作用。由于miRNA的內源性及相對安全性，利用其靶向攻擊外源性病毒這一特性開發相應的藥物或方法，可以模擬機體抗病毒免疫，為預防和/或治療病毒感染誘發惡性疾病(如丙型肝炎、乙型肝炎、艾滋病等)帶來了新的契機。
[0006]然而，宮頸癌作為與病毒感染明確相關的惡性腫瘤中的一種，到目前為止還沒有任何文獻報道某種miRNA可以直接靶向HPV病毒、調控HPV病毒基因的表達。尚未見任何一種人類miRNA應用于抗HPV病毒。而阻斷HPV持續感染恰恰是預防和治療宮頸癌的關鍵。
【發明內容】
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[0007]鑒于上述技術背景，本發明的目的在于提供一種新的用于由HPV感染及宮頸癌的治療祀點及方法。
[0008]具體的，本發明提供了一種可用于預防和治療人乳頭瘤毒的感染以及由該病毒所引起的宮頸癌的微小RNA核酸序列，具體為:5’AUAUACCUGUUCGGUCUCUUUA3’。本發明的一個實施例中，所述微小RNA可以靶向人乳頭瘤病毒E6基因的第207-232nt，所述第207_232nt的序列為:5’ AACAGTTACTGCGACGTGAGGTATAT3’。
[0009]本發明還涉及上述微小RNA及其各種載體、藥物組合物在預防和治療HPV病毒感染以及由該病毒引起的宮頸癌的藥物中的用途。
[0010]所述藥物組合物指含有有效量的上述核酸序列以及藥學上可接受的賦形劑。
[0011]本發明中，所述人乳頭瘤病毒可以引起人宮頸癌的高危亞型，包括:HPV16，HPV18HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82。
[0012]另外，本發明還涉及用本發明提供的上述核酸序列、載體或藥物組合物來調控HPVE6基因的表達。
[0013]本發明中，所述的微小RNA可以下調人乳頭瘤病毒E6基因表達，并最終抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞的凋亡。
[0014]本發明通過生物信息學方法預測出上述微小RNA的核酸序列。進而，本發明將該微小RNA及其預測靶標序列分別克隆于雙熒光素酶報告基因載體內，結果發現報告基因活性明顯被抑制，證實該微小RNA可與該靶標相互作用。為了評價該微小RNA對HPV16感染的宮頸癌細胞生長的影響，本發明將該微小RNA表達質粒轉染入HPV16陽性的宮頸癌SiHa細胞株，流式細胞儀檢測法、Hoechst染色法、Roche細胞分析儀檢測法結果均顯示外源性上調細胞內該微小RNA的表達可明顯減緩細胞增殖、增加細胞凋亡，證實該微小RNA介導的對HPV病毒的沉默效應可以干擾腫瘤細胞的生長結局。同時，RT-PCR法結果顯示E6癌基因的mRNA表達明顯減少。由此，本發明證實了該微小RNA可通過靶向HPV16-E6基因，直接靶向攻擊HPV16病毒，影響病毒的致癌能力，從而有效抑制宮頸癌細胞的生長、誘導宮頸癌細胞凋亡。鑒于miRNA的內源性及相對安全性，如果將其應用于藥物，模擬人類細胞受到HPV感染后免疫系統產生的抗病毒免疫反應，將有望成為一種新型的預防和治療HPV感染以及由HPV感染引起的宮頸癌的治療方法及要素。
【附圖說明】
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[0015]圖1:將該微小RNA序列克隆于pSilenCer4.1-CMV載體內，其預測靶標序列克隆于psiCheck-2載體內，兩種重組質粒共轉染于HPV陰性的宮頸癌C33A細胞，為實驗組；空白質粒和靶標熒光報告基因質粒共轉染C-33A細胞，為對照組。圖1顯示了轉染48小時后檢測的熒光素酶活性:實驗組的熒光活性比對照組減少29.23%，報告基因表達明顯被抑制，數據具有統計學意義(P〈0.001)
[0016]圖2:將該微小RNA表達質粒(pSilencer4.l-miRNA-CMV)轉染入HPV16陽性的宮頸癌SiHa細胞株，為實驗組；未轉染質粒及轉染空白質粒的SiHa細胞為正常對照組及陰性對照組。圖2顯示了流式細胞儀檢測細胞凋亡率結果:實驗組的早期凋亡率分別為正常對照組和陰性對照組的3.1倍和2.6倍，晚期凋亡率分別為9.5倍和10.4倍，總凋亡率分別為5.8倍和5.4倍，差異有統計學意義(P〈0.05)。
[0017]圖3:顯示了 Hoechst染色法檢測SiHa凋亡細胞結果:實驗組細胞熒光染色陽性率分別為正常對照組和陰性對照組的43.3倍和23.9倍。差異有統計學意義(P〈0.001)。
[0018]圖4:顯示了由Roche xCELLigence RTCA DP細胞分析儀監測的SiHa細胞增殖指數繪制的細胞生長曲線:轉染了微小RNA表達質粒的實驗組的細胞