一種用病毒樣顆粒包被量子點的方法【
技術領域：
】[0001]本發明涉及一種示蹤物質的制備方法，確切講本發明涉及一種用病毒樣顆粒包被量子點的方法，以及用這種方法制備的物質及應用。【
背景技術：
】[0002]病毒樣顆粒(Virus-likeParticles,VLPs)，也稱為核心樣顆粒(Core-likeParticles,CLPs)，是由病毒的結構蛋白組裝而成的介于15nm?400nm的空心顆粒。VLPs不含病毒基因組，不能自主復制，在形態上與真正病毒粒子相似，可通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細胞，有效誘導機體產生免疫保護反應。病毒的衣殼蛋白一般具有天然的自我裝配能力，這為病毒的基礎研宄及疫苗的開發提供了便利條件。其中一些VLPs允許外源抗原基因的插入或融合，產生在表面展示外源表位的嵌合病毒樣粒子(cVLPs)，或是通過化學方法將包括非蛋白類抗原在內的抗原偶聯至粒子表面。多數VLPs具有包裹核酸或其它小分子的能力，可以用作基因或藥物的運載工具。至今，已構建成功多種人類和動物病毒的VLPs。這些病毒粒子包裝形成也各不相同，有的僅需要單一衣殼蛋白、多個衣殼蛋白，有的還需要病毒脂質囊膜。病毒樣粒子具有的獨特結構、展示表位的能力和能有效刺激產生免疫反應為研宄預防多種疾病提供很好的方法。此外，VLPs也應用于研宄病毒包裝過程、形態以及病毒的體系結構。參見:Rodriguez-Limas,IA.,K.SekarandK.E.Tyo,Virus-likeparticles:thefutureofmicrobialfactoriesandcell-freesystemsasplatformsforvaccinedevelopment.CurrOpinB1technolj2013.24(6):p.1089-93.量子點(quantumdots,簡稱QDs)又可稱為半導體納米微晶體(semiconductornanocrystal),是一種由I1-VI族和II1-V族元素組成的納米顆粒。目前研宄較多的主要是I1-VI型量子點即由第二副族和第六主族元素組成的量子點，如CdS、CdSe、CdTe等。主要應用在光學、生物診斷和傳感器等領域。由于量子點的吸收光譜寬而連續，而發射光譜則窄而對稱，所以可以通過調節量子點的組成和大小達到光學性質可調性，同時光學穩定性明顯優于傳統的有機染料。此外，量子點表面的電子，空穴復合過程對許多外部作用非常敏感，據此可建立熒光傳感系統。如何制備量子產率高、性能穩定和具有特殊功能基團的量子點一直是研宄者追求的目標。目前，量子點的制備主要分為金屬有機合成和水相合成兩類方法。但是，由于量子點合成方法的限制以及材料自身的缺陷，使其在應用領域很受限制，所以如何將量子點合理化修飾成為近期研宄的熱點。為了改善量子點的單分散、水溶性以及發光穩定性，研宄者做了大量的努力。聚合物材料因為在電磁光譜的可見光區對量子點的光學性質沒有影響，所以成為量子點修飾的合適試劑。目前關于聚合物直接修飾量子點表面的研宄主要集中在生物學和光電子組裝方面，修飾后的量子點穩定性大大提高。通常聚合物包覆的量子點比有機小配體包覆的量子點穩定性要強。此外，通過采用聚合物包覆的方法，可以獲得各種各樣功能性的量子點表面。量子點表面直接功能化的成功關鍵在于量子點在功能化后依然能保持發光性質。參見Luo,Y.H.，etal.，Cadmium-basedquantumdotinducedautophagyformat1nforcellsurvivalviaoxidativestress.ChemResToxicol,2013.26(5):p.662-73.人們已經在細胞成像，免疫分析，DNA雜交，生物傳感器，共振能量轉移等方面得到了較為成功的探索與嘗試。在多數研宄中都涉及了量子點QDs與生物分子偶聯的問題，這一步往往是進行深入研宄的基礎。因此，只有對生物分子修飾QDs進行較為全面的研宄，才能更好地利用這一新型熒光物質。目前報道較多的量子點研宄主要有CdS，ZnS,CdSe,ZnTe、HgSe、CdS、CdTe、InAs、GaAs等。這些量子點具有激發光譜寬、可實現多種熒光光譜、較大的斯托克斯位移和較好的生物分析等特性.。但這些量子點從應用和環保角度來看，在獲得生物相容性好、無毒性影響，熒光亮度高、穩定不變、水溶性好的性能方面還有不少問題有待解決。參見:Woolley,R.,etal.,Fromparticletoplatelet:optimizat1nofastable,highbrightnessfluorescentnanoparticlebasedcelldetect1nplatform.Nanomedicine,2013.9(4):p.540-9.[2]LiF,ZhangZP,PengJ,etal.1magingviralbehav1rinMammaliancellswithself-assembledcapsid-quantum-dothybridparticles[M].2009:718-726.。【
發明內容】[0003]本發明提供一種可克服現有技術不足，具有:生物相容性好、無毒性影響，熒光亮度高、穩定不變、水溶性好、用病毒樣顆粒包被的量子點。[0004]本發明的用病毒樣顆粒包被量子點的方法是用2-巰基乙酸或3-巰基丙酸作為CdSe/ZnS油溶性量子點的表面修飾劑，用犬細小病毒重組結構蛋白溶液與經修飾后的CdSe/ZnS油溶性量子點按體積比5:1_10:1加入透析袋內，再在其中按照5%的體積比加入濃度為2mg/mlSUMO蛋白酶，混勻后置pH=6.8的緩沖液透析，通過犬細小病毒重組結構蛋白的自組裝特性將修飾后的量子點包裝入病毒樣顆粒內。[0005]本發明的用病毒樣顆粒包被量子點的方法中使用的犬細小病毒重組結構蛋白是犬細小病毒重組結構蛋白VP2。[0006]本發明的用病毒樣顆粒包被量子點的方法中，CdSe/ZnS油溶性量子點修飾方法為:將275μI的商品化的CdSe/ZnS正己烷溶液，加入到Iml的無水乙醇中，超聲處理后，離心棄上清后加入300μI氯仿進行溶解，然后加入Iml的2-巰基乙酸(MAA)或3-巰基丙酸(MPA)混勻，室溫下劇烈震蕩lh，再經離心處理棄上清，將沉淀用氯仿洗滌，再用Iml硼酸鹽溶液溶解沉淀。[0007]進一步，本發明的用病毒樣顆粒包被量子點的方法，是將2mg/ml的犬細小病毒VP2蛋白溶液和修飾后的0.2mg/ml的量子點溶液按體積比5:1加入透析袋內，按犬細小病毒VP2蛋白溶液和修飾后的量子點溶液體積之和的100:1加入SUMO蛋白酶，混勻后放入緩沖液中進行酶切包裝，得到目標病毒樣顆粒包被量子點。試驗中所用的緩沖液有PBS，TBS和HEPES緩沖液，pH值為6.6-7.8，其中:50mM/LTris-HCl,150mM/LNaClpH=6.8最好，可以在包裝效率和生物相容性兩方面達到最佳效果。[0008]采用前述的方法可以制備出包被量子點的病毒樣顆粒。[0009]本發明的包被量子點的病毒樣顆粒可在制備示蹤劑方面的應用，也可在制備用于研宄病毒入侵機制的試劑中的應用。[0010]采用病毒樣顆粒蛋白作為一種生物運載工具，這不僅解決了無機納米材料量子點在生物應用中存在的無機相容性問題，同時通過在量子點外部包覆一層病毒衣殼蛋白的形式，來降低量子點的生物毒性作用。犬細小病毒能夠選擇性的侵染正常細胞，在侵染細胞的方式上具有特異性；由犬細小病毒的VP2蛋白組裝成的VLP，具有與犬細小病毒相似的特性，VLP-QDs通過犬細小病毒侵入細胞的方式，利用宿主細胞轉鐵蛋白受體進入細胞，從而提高的QD進入細胞的靶向性。【附圖說明】[0011]圖1.瓊脂糖凝膠電泳圖，瓊脂糖凝膠電泳檢測修飾后表面電性，樣品與甘油按I:I混合均勻加樣，甘油起沉降樣品的作用。其中:MPA-QD是用3-巰基丙酸修飾的CdSe/ZnS量子點；MAA-QD是用2-巰基乙酸修飾的CdSe/ZnS量子點；QD是CdSe/ZnS量子點，VLP是犬細小病毒樣顆粒。[0012]圖2.Zetasizer檢測QD修飾前后的表面所帶電荷數和電性。其中:MPA_QD是用3-巰基丙酸修飾的CdSe/ZnS量子點；MAA_QD是用2-巰基乙酸修飾的CdSe/ZnS量子點。[0013]圖3.TEM透射電鏡圖片，其中㈧為CdSe/ZnS量子點的透射電鏡圖；(B)為MPA-CdSe/ZnS量子點的透射電鏡；(C)為犬細小病毒樣顆粒的透射電鏡；(D)為犬細小病毒樣顆粒包被的量子點的(VLP-QD)透射電鏡圖。[0014]圖4.用Nanosizer檢測不同比例的VP2蛋白與QD包覆后的粒徑大小曲線。[0015]圖5.用紫外連續光譜檢測不同比例的VP2蛋白與QD包覆后的吸光率曲線。[0016]圖6.MTT法檢測MPA-QD和VLP-QD的細胞毒性曲線。其中:MPA_QD是用3-巰基丙酸修飾的Cd當前第1頁1 2