經血間充質干細胞的培養方法
【專利說明】經血間充質干細胞的培養方法
[0001]
技術領域
[0002]本發明涉及一種制備經血間充質干細胞的方法，屬于干細胞技術領域
【背景技術】
[0003]胚胎干細胞(ESCs)具有細胞全能性可以分化成全部三層胚層細胞層的多種細胞類型。但是胚胎干細胞的成畸胎瘤的潛在性和其在大型臨床應用方面的局限性嚴格限制了它在科學研究中的應用。但是，隨著患有無數病癥的患者的數目的增多，我們正在迫切的尋找具有使用臨床價值的其他干細胞來源。許多其他來源的干細胞都可以用于在早期的臨床試驗，如心臟病，脊髓損傷，骨和軟骨修復等。許多組織和器官的基質干細胞碎片都在體外顯現了其多分化潛能性，因為它們可以分化成諸如神經原細胞系和生心細胞系，成骨細胞系，軟骨細胞系和成脂細胞系。事實上，基質細胞可以分化成外胚層和中胚層細胞系，它們可以進一步進行它們的多潛能性分化。那么現在我們所面臨的問題則是是否可以安全獲得一個基質干細胞來源，其中這些干細胞都具有自我更新能力和原有的多分化潛能性。最近，基質干細胞已經被發現存在于子宮內膜組織內。但是直接獲得這些細胞卻是一個很具有損害性的過程。在每個月經周期都會有組織和血管的大量增長，這一增長過程會隨著月經周期的結束而停止。經血以及這些組織中含有一些具有可再生能力的細胞的異質群體。子宮基質細胞含有的多分化潛能性標志物與骨髓間質干細胞中存在的相同，事實上子宮基質細胞中的這些標志物部分是來源于骨髓的。
[0004]
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種經血來源樣品在制備間充質干細胞中降低污染率的應用和經血間充質干細胞的培養方法。該分離制備的方法中用到物理的方法對樣品進行初步的清洗并除去大部分細菌，再通過羥乙基淀粉(HES)對樣品進行分離，獲得經血間充質干細胞。所用到的方法簡單易行，操作方便，并且能最大量獲得所需的干細胞并培養成功。
[0006]經血間充質干細胞常采用淋巴細胞分離液分離獲得經血干細胞，多用含10%FBS的培養基培養，多用含10%DMS0的凍存液凍存。
[0007]現有技術中，制備經血間充質干細胞的方法通常會存在以下不足之處:
1)經血干細胞分離的現有技術，無法除去經血采集過程中流經陰道而附帶的細菌，防污染措施作用有限，原代培養污染率高，缺少從采集源頭開始減少污染的方法，目前在培養環節添加抗生素只能在培養過程中抑制污染菌繁殖，不能有效減少污染；
2)現有分離方法，沒有除去經血中細菌或真菌的操作步驟
3)現有的分離方法，不能獲得最大量的經血原始的干細胞，而本實驗方法可以最大量的獲得原始的經血干細胞 4)干細胞培養過程中細胞易衰老，細胞扁平，增值緩慢或停止增殖，失去分化能力等，目前尚未有方法或技術經驗闡述有效維持經血間充質干細胞形態，防止細胞老化，維持細胞在增殖過程中保留分化能力；
5)間充質干細胞長期傳代后可能發生端粒酶失活、癌基因表達增高抑癌基因表達下降、核型改變等風險，目前缺少經血間充質干細胞這方面的研究資料。
[0008]本發明采用的技術方案為:
本發明的目的是克服現有技術的不足之處，提供一種制備經血間充質干細胞的方法，包括以下步驟:
I)使用月亮杯采集女性經期中第二天或第三天的經血作為原料；將采集到的經血倒入裝有保存液的無菌容器中，4°c保存。
[0009]2)48h內將浸泡在經血保存液中的經血運至實驗室，將經血和保存液充分混勻，轉移至離心管中，首次離心為800-1000g/5-15min，除去上清。加入清洗，充分混勻，再次離心為 300-700g/5-15min，除去上清。
[0010]3)加入1%_6%羥乙基淀粉(HES)，充分混勻后，靜止10_60分鐘，取上層稍微清晰層，離心取得原始經血中的經血干細胞。
[0011]4下層繼續加入新的1%_6%羥乙基淀粉(HES)，充分混勻后，靜止10_60分鐘，取上層稍微清晰層，離心取得原始經血中的經血干細胞。(重復2-3次)
5)將兩次離心獲得的原始經血干細胞，使用無血清培養基進行培養，其中PO代蛻膜間充質干細胞長滿至80%-90%的密度后，使用0.25%胰酶消化，消化時間為3-5min，PO代之后，細胞在傳代操作后48-72h內進行傳代,要求傳代時細胞密度達到80%-90%以上,傳代后細胞按3-8 X 13個/cm2密度接種，培養過程中注意觀察培養基PH值變化，一旦PH變黃添加新鮮培養基并去除培養器皿中等量舊培養基，細胞從PO代傳代，傳至Pl?P30中間的任何一代次；
6)PO?P30代蛻膜間充質干細胞的凍存:每16-1O7細胞加入Iml凍存液，放入凍存盒，轉入_80°C冰箱，12?24h后轉入-196°C液氮或氣氮中保存備用；
其中，
所述的步驟I)和步驟2)中的保存液為0.9%生理鹽水或者PBS，加入相應的抗生素和抗凝劑。抗生素濃度為終濃度為0.5-3%的青霉素和鏈霉素以及終濃度為l-10ug/ml的兩性霉素B，以及肝素
所述的步驟2)中的清洗液為0.9%生理鹽水或者PBS，加入相應青霉素、鏈霉素、兩性霉素B。其中青霉素和鏈霉素為0.5-3%的終濃度,兩性霉素B為l-10ug/ml的終濃度。
[0012]所述的步驟5)中的無血清培養基由以下成分組成:DMEM/F12、PDGF-BB, bFGF、(TGF) - β 1、EGF 和 Transferrin ;其中，PDGF-BB 含量為 50 ?100 ng/mL ;bFGF 含量為 O ?50 ng/mL ； (TGF) - β I 含量為 O ?20ng/mL ；EGF 含量為 O ?30 ng/mL ；Transferrin 含量為2.0 ?4.5 mg/mL ；
所述的步驟6)中的經血間充質干細胞凍存液由基礎液、滲透性冷凍保護劑所說的滲透性冷凍保護劑濃度為1-1.4 mol/L所說的基礎液為培養液DMEM/F12 ;所說的滲透性冷凍保護劑為二甲基亞砜。
[0013]本發明的制備蛻膜間充質干細胞的方法，具有如下技術效果: I)選擇經期中第二或第三天的經血作為原料，保存于保存液中，可以防范污染方法，從源頭減少污染幾率。
[0014]2)差異離心洗滌經血樣品，利用密度差盡量除去細菌，有效減少污染幾率；
3)本專利方法中在分離經血間充質干細胞時候，采用羥乙基淀粉多次沉淀法，可最大量的獲得經血原始干細胞，提高生產量；
4)使用無血清培養基培養減少動物源成分使用，細胞可按此方法從PO代傳代至P30維持性能穩定，可維持蛻膜間充質干細胞在體外長期培養過程，維持細胞形態、增殖能力、MSC表面標記表達、分化能力，還可維持經血間充質干細胞在體外長期培養過程，維持端粒酶表達、癌基因穩定表達、核型穩定；
5)本方法中酶消化和凍存復蘇對細胞無傷害。
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【附圖說明】
[0016]圖1是經血樣品羥乙基淀粉沉淀靜止時的實驗圖圖2是經血樣品原代培養的經血間充質干細胞形態圖圖3是經血間充質干細胞的表面標記檢測結果圖；
圖4是采用無血清培養基培養的PO?PlO代蛻膜間充質干細胞形態圖；
圖5是采用無血清培養基培養的P2、P5和PlO代蛻膜間充質干細胞，與老化細胞和未分化細胞形態的對照圖；
圖6是生長曲線測定檢測結果圖；
圖7是成骨、成脂、成軟骨誘導分化檢測結果圖；
圖8是不同代次經血干細胞流式檢測結果圖；
圖9是端粒酶檢測結果圖；
圖10是癌基因檢測結果圖；
圖11是G顯帶核型分析結果圖。
【具體實施方式】
[0017]實施例1制備蛻膜間充質干細胞
本實施例中的制備經血間充質干細胞的方法，包括以下步驟: