缺失phoP的鴨疫里默氏桿菌CH1減毒菌株及構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及缺失#〇扣勺鴨疫里默氏桿菌CHl減毒菌 株及構建方法。
【背景技術】
[0002] 鴨疫里默氏桿菌RA)主要引起傳染性楽膜炎，侵 害包括雛鴨、鵝等多種禽類，表現為急性或慢性、敗血性、接觸性傳染病。在我國主要流行血 清型有血清1型，2型和10型。鴨傳染性漿膜炎主要在10-35日齡的雛鴨發病，發病率可 達90 %以上，死亡率為5 % -75 %，耐過鴨導致動物出現生長緩慢，給養殖業造成了巨大的 經濟損失。目前，鴨疫里默氏桿菌病的防治主要依靠抗生素治療，然而隨著多種藥物耐藥性 的不斷增加以及對食品安全性等問題的考慮，疫苗免疫是控制疫病發生與傳播的最經濟、 最有效的手段。國內對于滅活疫苗的研究較多，如鴨傳染性漿膜炎滅活苗、鴨疫里默氏桿菌 和大腸桿菌蜂膠二聯滅活苗、鴨疫里默氏桿菌多價滅活苗研制等，而且市場上已經有針對 血清1型，2型和10型的滅活疫苗在銷售。而這些疫苗存在缺陷：如應用比較廣泛的油乳 劑滅活苗無法提供完全保護（70%左右的保護率）且存在注射吸收不理想，毒株覆蓋不完全 等問題，研制新的、高效、覆蓋多種血清型的鴨傳染性漿膜炎疫苗成為我國養禽業發展的迫 切需求。
[0003] 位于膜上的遲白構成雙組分調節系統，參與一系列生物學過程，包括 調控毒力基因的表達、增強細菌對多種限制性生長環境，如低Mg2+、低酸、氧化物、金屬離 子、鹽的的適應能力、激活廣譜抗生素的耐藥性、增強細菌的免疫逃避能力，如因激 活的可以裂解α-螺旋的多肽C18G。而在鴨疫里默氏桿菌中全局調控基因開究 尚未見報道。現有技術也沒有報道通過對# 〇用女造是否可以獲得減毒菌株。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的之一是提供一株缺失#0/?勺鴨疫里默氏桿菌CHl減毒菌株，該減毒 菌株敲除了 #0/?因片段；所述因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，該減 毒菌株的分類命名為/PieffiereJ7a aflaiipesii/er CHlA/7Α0Λ保藏于武漢市武昌洛珈山的 中國典型培養物保藏中心（武漢大學），保藏號為CCTCC M 2014557,保藏時間為2014年11 月07日。
[0005] 所述減毒菌株中的因片段由沖％抗性基因所替代。
[0006] 所述壯觀霉素抗性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0007] 本發明的目的之二是提供缺失#0/?勺鴨疫里默氏桿菌CHl減毒菌株的構建方法。 該方法包括如下步驟： 1) 構建重組自殺質粒pREl 12- Δ : 2) 將步驟1)所得重組自殺質粒轉化入到x7213大腸桿菌中； 3) 將步驟2)中含有重組質粒的x7213大腸桿菌與鴨疫里默氏桿菌CHl菌自然結合，使 同源臂導入鴨疫里默氏桿菌CHl菌的基因組中，經過同源臂交換和壯觀霉素抗性篩選得到 陽性克隆； 4)通過PCR篩選得到缺失因的鴨疫里默氏桿菌CHl減毒菌株。
[0008] 所述步驟3)中，將含有重組質粒的X7213大腸桿菌與鴨疫里默氏桿菌CHl菌自 然結合時，具體的結合步驟為：分別將含有重組質粒X7213菌株與 鴨疫里默氏桿菌CHl培養至OD6qq=O. 6-0. 8,按體積比3:2的比例，在固體平板培養基上混 合，37°C下，于5% C02培養箱中培養18-24h，將菌苔刮下，劃線于含有50μ g/ml的和 150 μ g/m的的胰蛋白大豆肉湯固體平板培養基上進行培養，挑取生長的單菌落。
[0009] 所述步驟4)中，PCR篩選的步驟為： (1) 鴨疫里默氏桿菌CHl保守序列引物 F ： CATGCCATGGTGAGACAACTTAAAATTACC R ：CGCGGATCCTTTTCCTAAATAAGACTTC PCR擴增鴨疫里默氏桿菌CHl的特異性基因的864bp片段，判定候選突變株是否為鴨疫 里默氏桿菌CHl ; (2) 以抗性基因的引物 Spec-F ：GCACCTGCAGGGACCAGCCAGGACAGAAA Spec-R ：ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG 擴增抗性片段的1185bp片段，判斷是否發生基因的替換； (3) 以引物 phoP-up-F ：ACAGGAAATAGATAAACAAG phoP-down-R ：GGCCAAGATGATACATCAACG 進行擴增以檢測替換片段是否正確； (4) 以引物 phoP-F:CATGCCATGGTGCAAAAAATATTAATTG phoP-R:CGCGGATCCTTTTTTAACAAAGTTGGAA 擴增目的基因以檢測是否#〇/^是否被缺失。
[0010] 所述重組自殺質粒PRE112- : 的構建方法，包括如下步驟： 因的左右同源臂的引物設計： phoP-up-F ：ACAGGAAATAGATAAACAAG phoP-up-R ：CCTGCAGGATTGCGGCCGCAGAACAAAGATAGTTATATTT phoP-down-F ：GCGGCCGCATCCCTGCAGGTAACAAGAGAAATATTAGCC phoP-down-R ：GGCCAAGATGATACATCAACG 2) 以鴨疫里默氏桿菌CHl全基因組作為模板，分別對phoP基因的左右臂進行PCR擴 增，回收產物用引物phoP-up-F和phoP-down-R進行擴增，得到左右同源臂產物； 3) 利用加 A試劑盒對同源臂末端進行加 A處理，然后與用AhdI限制性內切酶處理的 PRE112自殺質粒產物進行連接，將連接產物轉入汰腸桿菌感受態中； 4) 將步驟3)所得C7232大腸桿菌搖菌培養至對數期，進行質粒抽提，得到重組質粒 pRE112-/7Ao/*;在 phoP-up-R 和 phoP-down-F 引物間引入 NotI 和 SbfI 酶切位點； 5) 抗性基因的引物設計 spec-F ：GCACCTGCAGG GACCAGCCAGGACAGAAA Spec-R ：ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG ； 將抗性基因的引物進行PCR擴增，PCR擴增片段回收后用NotI和SbfI進行 雙酶酶切，再與經NotI和SbfI雙酶酶切處理的pRE112-A#o/^接，得到重組質粒 pREl 12- Δ :
[0011] 所述重組自殺質粒pREm-A/^o/7: 的構建方法的步驟2)中，對phoP基因 的左右臂進行PCR擴增時，具體PCR擴增條件為：先于94°C變性2 min，經98°C變性10s、 55°C退火10s、72°C延伸15s，循環擴增35次，再于72°C延伸lOmin。
[0012] 所述步驟5)重組自殺質粒pREld/^o/7: 的構建方法的步驟2)中，對spec 抗性基因的引物進行PCR擴增時，具體PCR擴增條件為：先于94°C變性2min，經98°C變性 10s、55°C退火10s、72°C延伸20s循環擴增35次，再于72°C延伸IOmin。
[0013] 由于口1^112-八/7力〇/?::5776^重組質粒不能在狀中復制存活，將轉入有重組質粒的 C7213菌株與RA結合，使同源片段導入RA基因組中，利用壯觀霉素抗性篩選得到陽性克隆。 再利用PCR方法鑒定得到突變株。
[0014] 藥敏試驗表明鴨疫里默氏桿菌CHl菌株天然就對很多抗生素不敏感，利用壯觀霉 素抗性基因片段進行重組質粒的構建，具有較好效果。
[0015] 本發明的第三個目的是提供該減毒菌株在疫苗上的應用。
[0016] 本發明的有益效果： 1、目前，對鴨疫里默氏菌的毒力因子認識較少，用于構建鴨疫里默氏菌減毒菌株的方 法十分有限，本發明通過敲除鴨疫里默氏菌中的因，成功構建了缺失因的鴨 疫里默氏桿菌CHl的減毒菌株。
[0017] 2、本發明構建的減毒菌株可用于鴨疫里默氏桿菌基因減毒疫苗，用于研制預防多 個血清型的鴨疫里默氏桿菌的感染或者作為疫苗載體。
[0018] 3、本發明構建的減毒菌株可用于對鴨疫里默氏桿菌基因調控網絡的構建，為后續 研究奠定基礎。
【附圖說明】
[0019] 圖1 :是本發明中用于構建鴨疫里默氏桿菌桿菌因突變株示意圖，圖中， PhoP :鴨疫里默氏桿菌CHl #0/?因，B739-2186 :鴨疫里默氏桿菌CHl #0/?因上游鄰 近的讀碼框，B739-2188 :鴨疫里默氏桿菌因下游鄰近的讀碼框； 圖2 :為重組質粒pREld/^o/7: : spec質粒圖譜； 圖3 :為鴨疫里默氏桿菌變株構建鑒定，其中1為保守序列擴增，2為壯觀霉素 抗性片段擴增，3為的基因擴增，4為ph〇P-up-F/ph〇P-up-R擴增野生株替換片段全 長； 圖4 :為鴨疫里默氏桿菌親本株生長曲線圖，其中，RA-CHl為野生株， RA-CHl Λ為本發明減毒菌株； 圖5 :是本發明中鴨疫里默氏桿菌突變株對鴨胚成纖維細胞侵襲力和粘附力的結果； 其中，左側Adherence代表粘附力實驗，右側invasion代表侵襲力實驗，RA-CHl為野生株， RA-CHl Λ #0/?本發明減毒菌株； 圖6 :為鴨疫里默氏桿菌突變株及親本株在動物機體組織載量測定，其中，左側Liver 代表是本發明減毒菌株RA-CHl 其親本株在接種后12h、24h肝臟中細菌組織載 量，右側Brain代表是RA-CHl 其親本株在接種后12h、24h大腦中細菌組織載量， phoP-12h和phoP-24分別為本發明減毒菌株接種12h和24h的載量，RA-12h和RA-24h分 別為親本株接種12h和24h的載量； 圖7 :是本發明中不同劑量鴨疫里默氏桿菌突變株對試驗動物生長的影響情況。其中 1 (phop-Ι)為免疫劑量6. I X IO9CFU組，2 (phop-2)為免疫劑量6. I X IO8CFU組，對照組1 為不免疫不攻毒，對照組2為不免疫但用10XLD5tl攻毒組。
【具體實施方式】
[0020] 下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用 于對本發明進行進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練 人員根據上述
【發明內容】
所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。
[0021] 實施例1 鴨疫里默氏桿菌（RA-CHl)減毒菌株的制備： 所述的鴨疫里默氏桿菌為四川農業大學禽病中心實驗室保存（RA-CH1)，所述的沙門氏 菌為鼠傷寒沙門氏菌UK-I 大腸桿菌為大腸桿菌工程菌，如c7232，c7213，c6212 等。
[0022] 第一步，鴨疫里默氏桿菌血清I (RA-CHl)潛在因功能鑒定，根據鼠傷