一種雙活性木聚糖降解酶工程菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及應用微生物技術領域，具體涉及一種雙活性木聚糖降解酶工程菌，以 及該困在制備低聚木糖中的應用。 技術背景
[0002] 低聚木糖又稱木寡糖，由2?7個木糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成，以木二糖，木 三糖為主。各項研究表明，低聚木糖，尤其是木二糖，具有顯著的雙歧桿菌增殖能力，不被消 化性，無齲齒性以及促進人體對鈣的吸收等特性，因此，低聚木糖作為一種新型功能性低聚 糖成為食品工業研究開發的熱點之一。
[0003] 目前低聚木糖生產方法包括：酸水解法、熱水抽提、霉菌深層發酵和酶法等，木聚 糖酶水解法是低聚木糖生產的主要方法，即將玉米芯用氫氧化鈉溶液浸提，然后用酸中和、 過濾，濾液經過處理后直接添加木聚糖酶來制備低聚糖。但是，在玉米芯，甘蔗渣和秸桿 等農林廢棄物中約94%的半纖維素是阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖，這類木聚糖是一條以 β -1，4糖苷鍵相聯的木聚糖主鏈，上面帶有1，3-阿拉伯糖或1，2-4-0-甲基葡萄糖醛酸構 成的側枝，尤其是4-0-甲基葡萄糖醛酸側枝，無論是草類，軟木還是硬木來源的木聚糖，其 均中含有，這些側鏈的存在妨礙了木聚糖酶對木聚糖底物糖苷鍵的水解[9-10]，研究表明， 木聚糖酶和α -葡萄糖醛酸酶具有協同水解作用，不僅能加速低聚糖的產生，而且能使酶 解產物中帶有葡萄糖醛酸側枝的大片段得到有效水解，提高低聚木糖的產量和純度。但是2 種酶的大量制備勢必帶來能耗和成本的增加，因此，構建一種雙活性木聚糖降解酶工程菌， 使其既產α -葡萄糖醛酸酶又產木聚糖酶，不僅提高酶水解活性，而且簡化酶制備和水解 操作步驟，成為獲得更高效降解秸桿木聚糖和價格低廉的生物催化劑的途徑。目前尚未見 報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種雙活性木聚糖降解酶工程菌，以及該菌在制備低聚木糖 中的應用。
[0005] 本發明的一種雙活性木聚糖降解酶工程菌，是將木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶 基因分別置于不同表達盒下，通過優化翻譯起始區使其高效表達而構建得到共表達載體 pET-28a-xynB-aguA，并轉化大腸桿菌宿主細胞后獲得的重組菌。
[0006] 其中所述的共表達載體pET-28a-xynB_aguA是將木聚糖酶基因及其表達元件和 翻譯起始區序列SEQ : ID NO. 1或3和α-葡萄糖醛酸酶基因及其表達元件和翻譯起始區序 列 SEQ :ID NO. 2 或 4,分別在 Xba I /Xho I，Stul/Xhol 位點插入 pET-28a 而獲得。
[0007] 本發明還公開了所述的雙活性木聚糖降解酶工程菌在用木聚糖制備低聚木糖中 的應用。
[0008] 上述應用，具體是利用所述的雙活性木聚糖降解酶工程菌產生的雙活性木聚糖降 解酶的粗酶液水解木聚糖底物制備低聚木糖。
[0009] 所述的木聚糖底物，是從農林廢棄物、食品加工的下腳料中提取的木聚糖中任何 一種，或農林廢棄物汽瀑液。
[0010] 雙活性木聚糖降解酶水解木聚糖底物的反應條件：溫度65-90°C，pH5-8。
[0011] 本發明利用基因重組技術將極端嗜熱袍菌屬（Thermotiga)的木聚糖酶（XynB) 和α-葡萄糖醛酸酶（AguA)基因連接到大腸桿菌（E. coli)表達載體pET_28a ( + )上，且 分別置于不同表達盒下，并通過利用優化翻譯起始區使木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶高 效生產的引物，其序列如SEQ :ID NO. 5、ID NO. 6、ID NO. 7和ID NO. 8所示，構建得到表達 載體pET-28a-xynB-aguA，轉化大腸桿菌E. coli JM109(DE3)后獲得重組工程菌E. coli JM109(DE3)/pET-28a-xynB-aguA ;該菌在含有30-50μ g/mL卡那霉素抗性的LB培養基中 30°C溫度培養至對數生長期，經異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)或乳糖和37-42°C誘導培養可 獲得高效表達的雙活性木聚糖降解酶；進一步利用所得的雙活性木聚糖降解酶對木聚糖的 降解表現出比單一木聚酶更高效率，且所得酶解液中木二糖的含量和純度更高。
[0012] 本發明通過因重組技術將性能優良的極端嗜熱袍菌屬（Thermotiga)的木聚糖酶 (XynB)和α-葡萄糖醛酸酶（AguA)基因分別置于不同表達盒下并通過優化翻譯起始區二 級結構進行獨立共表達獲得雙活性木聚糖降解酶，不僅能提高酶水解木聚糖的活性，而且 可簡化酶制備和水解操作步驟，降低生產成本低；所得到的雙活性木聚糖降解酶對木聚糖 降解獲得木二糖含量和純度更高的低聚木糖，這不僅排除了供體菌共生的其他一系列酶系 的干擾，而且相對單一木聚糖酶，具有轉化效率高，反應副產物少，產物分離和純化容易等 優點。
【附圖說明】
[0013] 圖1重組工程菌Ε. coli JM109(DE3)/pET-28a-xynB-aguA在不同誘導時間和誘導 劑濃度下的粗酶液SDS-PAGE圖譜
[0014] M :蛋白分子量標樣；1:空載對照；2:優化前對照；3 :誘導培養6h的細胞上清液； 4 :誘導培養8h的細胞上清液；5 :誘導IOh的細胞上清液，6 :50mM IPTG下誘導的的細胞上 清液；7 :100mM IPTG下誘導的細胞上清液；8 :800mM IPTG下誘導的細胞上清液。
[0015] 圖2重組工程菌E. coli JM109(DE3)/pET-28a-xynB-aguA在不同誘導溫度下的粗 酶液SDS-PAGE圖譜和XynB/AguA比例分析
[0016] M :蛋白分子量標樣；1，7, 10 :空載對照；2, 3:在37°C誘導條件的全細胞液和細胞 上清液；4 :空載對照；5, 6 :在39°C誘導條件的全細胞液和細胞上清液；8, 9 :在41 °C誘導條 件的全細胞液和細胞上清液；11，12 :在42°C誘導條件的全細胞液和細胞上清液
[0017] 圖3雙活性木聚糖降解酶和單一木聚糖酶水解樺木木聚糖的還原糖釋放量
[0018] 圖4雙活性木聚糖降解酶和單一木聚糖酶水解樺木木聚糖的TLC圖譜1:木二糖 標樣；2, 11:木糖標樣；3-6:單一木聚糖酶水解樺木木聚糖水解樺木木聚糖1、2、4、8小時 的酶解液；7-10:雙活性木聚糖降解酶水解樺木木聚糖1、2、4、8小時的酶解液。
【具體實施方式】
[0019] 以下是本該發明的具體實施例，但本發明的內容并不僅局限于此。
[0020] 實施例1:
[0021] 根據海棲熱袍菌Thermotiga maritima的木聚糖酶B (XynB)基因（TM0070)序列 設計引物，其序列具體是：
[0022] 5' -TGCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAATGAGT
[0023] CAGAATGTAAGCTTGAGAGAACTCGCGGAAAAGCTGAACATCTATATTGG-3'（SEQ ID NO. 5)和 5, -CGGCTCGAG AGGCCTCAAAAAACCCCTCAAGA
[0024] CCCGTTTA