一種粉狀畢赤酵母高密度發(fā)酵工藝方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種粉狀畢赤酵母高密度發(fā)酵工藝方法，該發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，成本低，采用葡萄糖流加方式促進(jìn)菌體積累，適用于粉狀畢赤酵母的高密度發(fā)酵生產(chǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002]粉狀畢赤酵母作為發(fā)酵工業(yè)菌種具有非常特殊的優(yōu)越性，它不僅可以為飼料工業(yè)提供優(yōu)質(zhì)活性蛋白源，為生物肥料產(chǎn)業(yè)提供重要的菌種，還能高效分泌甘油等工業(yè)原材料與產(chǎn)品，因此大力發(fā)展粉狀畢赤酵母產(chǎn)業(yè)有非常廣闊的市場(chǎng)前景。目前市場(chǎng)上的粉狀畢赤酵母菌接種劑主要是粉劑，接種時(shí)需要大量的粉狀畢赤酵母活菌，因此研究粉狀畢赤酵母高密度發(fā)酵具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)對(duì)粉狀畢赤酵母的研究不多，其主要集中在脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生高活性3-磷酸甘油脫氫酶(GPDl)或者基因改造GPD1，使其分泌甘油的水平提高。張潔等(2006)研究了魯氏酵母3-磷酸甘油脫氫酶基因在粉狀畢赤酵母中的表達(dá)，并分別比較了重組菌和野生菌在不同鹽濃度下的細(xì)胞密度，其脅迫下的OD值都不高。高亮等人(2011)研究粉狀畢赤酵母對(duì)土壤鹽堿性有好的改良效果，以及對(duì)根結(jié)線蟲有較強(qiáng)的抑制作用，并驗(yàn)證了其生物菌劑對(duì)黃瓜的產(chǎn)量有明顯的提高效應(yīng)。而專門研究粉狀畢赤酵母高密度發(fā)酵的報(bào)道幾乎沒有。
[0004]畢赤酵母是近年來被廣泛用來作為表達(dá)外源蛋白的載體，粉狀畢赤酵母作為畢赤酵母家族中的一員具有舉足輕重的作用。目前粉狀畢赤酵母存在發(fā)酵液菌濃低、發(fā)酵周期較長(zhǎng)、培養(yǎng)基成本高等一系列問題，開發(fā)粉狀畢赤酵母高密度發(fā)酵廉價(jià)的、實(shí)用性較強(qiáng)的技術(shù)平臺(tái)對(duì)粉狀畢赤酵母菌劑的大面積推廣具有重要的意義。
[0005]本發(fā)明對(duì)粉狀畢赤酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了成分較簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基配方，同時(shí)，采用流加葡萄糖以促進(jìn)菌體積累，為粉狀畢赤酵母高密度培養(yǎng)提供了方法，也為甘油的生物合成及其他方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供了一種配方設(shè)計(jì)合理、且能夠提高菌體生物量的粉狀畢赤酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供了一種上述培養(yǎng)基的制備方法。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供了一種利用上述培養(yǎng)基對(duì)粉狀畢赤酵母進(jìn)行高密度發(fā)酵的方法。
[0009]本發(fā)明適用于獲取生物量更高的粉狀畢赤酵母高密度發(fā)酵，特別是本發(fā)明提供一種可以獲取粉狀畢赤酵母的高密度補(bǔ)料發(fā)酵方法。
[0010]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0011]對(duì)于粉狀畢赤酵母高密度發(fā)酵工藝的發(fā)酵培養(yǎng)基，其原料配方如下:
[0012]蛋白胨5?20g，
[0013]葡萄糖10 ?10g,
[0014]磷酸二氫鉀I?6g，
[0015]硫酸鎂0.1?2g，
[0016]玉米衆(zhòng)2?30g,
[0017]加蒸餾水補(bǔ)充至1000mL。
[0018]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0019]上述粉狀畢赤酵母的發(fā)酵控制方法的發(fā)酵培養(yǎng)基，其制備方法如下:
[0020]1、將蛋白胨5?20g、磷酸二氫鉀I?6g、硫酸鎂0.1?2g、玉米衆(zhòng)2?30g混合，用蒸餾水將固體全部溶解并補(bǔ)充至900mL，用5?8mol/L的NaOH調(diào)整pH到6.0?6.8，在103.4kPa壓力、115?121 °C溫度下滅菌20?30min得培養(yǎng)基；
[0021]2、稱取葡萄糖10?100g，加蒸餾水溶解并補(bǔ)充至10mL,在103.4kPa蒸汽壓力、110?117°C溫度下滅菌30min，得葡萄糖溶液；
[0022]3、將步驟2得到的葡萄糖溶液加入到滅過菌的步驟I的培養(yǎng)基中，得到粉狀畢赤酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0023]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0024]一種利用上述培養(yǎng)基對(duì)粉狀畢赤酵母進(jìn)行高密度發(fā)酵的方法，其步驟如下:
[0025](I)制備一級(jí)種子:取斜面保存的粉狀畢赤酵母如粉狀畢赤酵母ACCC21153或ACCC20026 (不限于該菌株，現(xiàn)有報(bào)道的或常用的或商業(yè)上可以購(gòu)買得到的粉狀畢赤酵母菌株均可以作為本發(fā)明的實(shí)施菌株)在YEro培養(yǎng)基平板上劃線，置28°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12h，出現(xiàn)游離單菌落，得到一級(jí)種子；
[0026](2)制備二級(jí)種子:用接種環(huán)取一環(huán)步驟(I)的一級(jí)種子的單菌落，接入裝有30?50mL YEPD液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L ;蛋白胨20g/L ;酵母粉10g/L)的250mL三角瓶中，在28?40°C條件下，150?200r/min下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌體OD6tltl達(dá)到10.0?12.0時(shí)即得二級(jí)種子；
[0027](3)發(fā)酵培養(yǎng):取步驟(2)的二級(jí)種子以V/V計(jì)為1%?5%的接種量接入裝有30?50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，控制搖床溫度為28?40°C，轉(zhuǎn)速為150?200r/min，發(fā)酵周期為20?30h，得到粉狀畢赤酵母菌；或
[0028]取步驟(2)的二級(jí)種子液以V/V計(jì)為1%?5%的接種量接入裝有按V/V計(jì)的40%?60%發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度為28?40°C，通風(fēng)比1-3.5VVM，起始轉(zhuǎn)速為300r/min,每隔4h轉(zhuǎn)速提升100r/min,提高至700r/min保持不變,發(fā)酵周期為20?30h,得到粉狀畢赤酵母菌；或
[0029]取步驟(2)的二級(jí)種子液以V/V計(jì)為1%?5%的接種量接入裝有按V/V計(jì)的40%?60%發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度為28?40°C，通風(fēng)比1_3.5VVM，起始轉(zhuǎn)速為300r/min，每隔4h轉(zhuǎn)速提升100r/min，提高至700r/min保持不變。在此發(fā)酵條件下培養(yǎng)10?16h后開始補(bǔ)料,之后每隔2h進(jìn)行一次補(bǔ)料,共補(bǔ)料5次，同時(shí)通過手動(dòng)流加5?8mol/L NaOH溶液使發(fā)酵液pH保持在6.0左右，發(fā)酵周期為20?30h，得到粉狀畢赤酵母菌；
[0030]其中，發(fā)酵補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí)所用補(bǔ)料葡萄糖的配置方法為:稱取葡萄糖50?200g，加蒸餾水溶解并補(bǔ)充至200mL，在103.4kPa蒸汽壓力、110?117°C溫度下滅菌20?30min，每IL發(fā)酵液每次加入量為20mL，使發(fā)酵體系中葡萄糖濃度為2?15g/L。
[0031]本發(fā)明設(shè)計(jì)的粉狀畢赤酵母高密度補(bǔ)料發(fā)酵方法有如下特點(diǎn):傳統(tǒng)的粉狀畢赤酵母發(fā)酵較多直接采用酵母粉作為氮源的YEro培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)菌體生長(zhǎng)過程能利用葡萄糖代謝產(chǎn)生乳酸，使發(fā)酵液PH迅速降低，從而抑制菌體生長(zhǎng)，但粉狀畢赤酵母能夠耐受12%的高鹽，因而可以在發(fā)酵過程中用一定濃度的NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵液PH保持在6.0左右，以促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)過程中通過在發(fā)酵過程中定時(shí)取樣測(cè)定pH、OD600和殘?zhí)呛?，發(fā)現(xiàn)葡萄糖在14小時(shí)已經(jīng)完全消耗完畢，因此在消耗完的前I小時(shí)，采用流加的方式補(bǔ)充葡萄糖作為發(fā)酵的碳源，以利于菌體繼續(xù)生長(zhǎng)。
[0032]經(jīng)相關(guān)的試驗(yàn)與對(duì)比可見，本發(fā)明利用玉米漿替代原始培養(yǎng)基中的酵母粉，采用葡萄糖流加補(bǔ)料方式的高密度發(fā)酵方法效率更高，生產(chǎn)成本更低，具有比現(xiàn)有粉狀畢赤酵母發(fā)酵技術(shù)更高的生物量。
[0033]本發(fā)明最終粉狀畢赤酵母菌體生物量OD6tltl可達(dá)85.0?95.0，菌數(shù)為30.0?35.0億/mL，含酵母菌體50.0?60.0g/L，遠(yuǎn)高于高密度發(fā)酵的30g/L的水平，而用常規(guī)的YEPD發(fā)酵，OD600為15.0?25.0，菌數(shù)為6.0?8.0億/mL。
[0034]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果:
[0035]1、本發(fā)明提供了粉狀畢赤酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基，降低了培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本；
[0036]2、粉狀畢赤酵母是好氧菌，高通風(fēng)比提高了菌體生物量；
[0037]3、NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，有效緩解低酸環(huán)境菌體生長(zhǎng)緩慢，且產(chǎn)生的高鹽濃度能有效降低雜菌的污染，在菌劑生產(chǎn)過程中能得到高純度的菌體；
[0038]4、采用葡萄糖補(bǔ)料的方法進(jìn)行發(fā)酵，延長(zhǎng)了對(duì)數(shù)期的時(shí)間，促進(jìn)了菌體的積累。
【附圖說明】
[0039]圖1為粉狀畢赤酵母ACCC21153在YETO培養(yǎng)基中的種子液生長(zhǎng)曲線；
[0040]圖2為發(fā)酵過程中不補(bǔ)糖不控pH條件下菌體生長(zhǎng)情況。圖中:
[0041]■_菌體生物量；
[0042]▼-發(fā)酵液 pH ；
[0043]O -發(fā)酵液殘留葡萄糖濃度。
[0044]圖3為發(fā)酵過程中控制pH與補(bǔ)糖條件下的菌體生長(zhǎng)情況。圖中:
[0045]■-菌體生物量；
[0046]▼-發(fā)酵液 pH ；
[0047]O -發(fā)酵液殘留葡萄糖濃度。
【具體實(shí)施方式】
[0048]下面申請(qǐng)人將結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做詳細(xì)的闡述，但以下內(nèi)容不在任何意義上解釋為對(duì)本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)范圍的限制。在下面的實(shí)施例中所使用的粉狀畢赤酵母菌株ACCC21153和ACCC20026為商業(yè)購(gòu)買的粉狀畢赤酵母菌株(購(gòu)自:北京，中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，http://www.accc.0rg.cn),在具體應(yīng)用中不限于該菌株,現(xiàn)有報(bào)道的或常用的或商業(yè)上可以購(gòu)買得到的粉狀畢赤酵母菌株均可以作為本發(fā)明的實(shí)施菌株。實(shí)施例1是粉狀畢赤酵母ACCC21153搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)情況，實(shí)施例2是粉狀畢赤酵母ACCC21153粉狀發(fā)酵罐分批發(fā)酵生長(zhǎng)情況，實(shí)施例3是粉狀畢赤酵母ACCC21153發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵生長(zhǎng)情況，實(shí)施例4是粉狀畢赤酵母ACCC20026發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵生長(zhǎng)情況。
[0049]實(shí)施例1:粉狀畢赤酵母ACCC21153搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
[0050]1、粉狀畢赤酵母ACCC21153高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0051](I)按下列配方備料
[0052]將蛋白胨15g、磷酸二氫鉀1.5g、硫酸鎂0.45g、玉米漿(工業(yè)級(jí)，蛋白含量> 45%、酸度< 14%、亞硫酸鹽< 0.3%、灰分< 10%) 15g混合，用蒸餾水將固體全部溶解并補(bǔ)充至100mL,用5?8mol/L氫氧化鈉調(diào)整pH到6.0，分裝于250mL搖瓶，裝液量為30mL，在103.4kPa蒸汽壓力、115 °C下滅菌30min ；
[0053](2)稱取葡萄糖48g，用蒸餾水溶解并補(bǔ)充至10mL,在103.4kPa蒸汽壓力、115°C下滅菌30min得葡萄糖溶液；
[0054](3