一種由肝素鈉粗品生產依諾肝素鈉的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生化原料藥生產技術領域，具體涉及一種由肝素鈉粗品生產依諾肝素 鈉的方法。
【背景技術】
[0002] 依諾肝素鈉是一種低分子肝素鈉鹽，通過對豬腸粘膜來源的肝素的芐基酯衍生物 進行堿解聚而獲得。由一系列未能完全定性的復雜寡糖組成，非還原端主要由4-烯醇式吡 哺糖醛酸組成，15 %?25 %的組分在還原端包含有1，6-脫水衍生物結構。其重均分子量為 3800?5000。按干燥品計算，抗Xa因子活性效價為90IU/mg?125IU/mg，抗IIa因子效價 為20. OlU/mg?35. 0IU/mg，抗Xa因子效價與抗IIa因子效價比為3. 3?5. 3。依諾肝素 鈉的抗凝作用與天然肝素相當或更優，而出血的發生比應用天然肝素更少，加之生物利用 度高，因而備受臨床青睞。目前依諾肝素鈉已用于預防靜脈栓塞性疾病（防止靜脈內血栓 形成），特別是與某些手術有關的栓塞；治療深靜脈栓塞，伴或不伴有肺栓塞；治療不穩定 性心絞痛及非Q波心梗，與阿司匹林同用；用于血液透析體外循環中，防止血栓形成等。
[0003] 目前國內外對依諾肝素鈉的制備方法較多，大多采用直接從肝素鈉通過成鹽、酯 化、氧化、超濾、干燥等步驟獲得[CN102050888B、CN 103342761A]。在生產過程中，肝素鈉 的質量對依諾肝素鈉終產品有很大影響。這是因為肝素鈉分子結構異常復雜，分子量難以 固定，不同工藝來源的肝素鈉直接影響依諾肝素的產品質量。依諾肝素鈉的結構與組成比 較復雜，在結構確認和質量標準控制上存在一定的不確定性，因而起始原料和生產過程的 研宄與控制就必須嚴格，且原料對后期依諾肝素鈉成品的分子量分布有直接影響。因此開 發從肝素鈉粗品直接生產依諾肝素鈉的新工藝可以從源頭和工藝控制原料質量，更有效保 證產品質量。在此前提下，盡可能降低能耗、減少環保壓力仍是本領域技術人員需要解決的 問題。CN102603925B提供一種由肝素鈉粗品直接生產依諾肝素鈉的方法，肝素鈉粗品先經 醇沉、氧化、醇沉得到沉淀物，此沉淀物用于制備依諾肝素鈉；該沉淀物經成鹽、酯化、降解、 樹脂、氧化、醇沉，最后溶解過濾、噴霧干燥得依諾肝素鈉成品。該方法中的肝素鈉除雜步驟 僅依靠有機溶劑的使用和采用氧化，不利于獲得高質量的終產品；由肝素鈉沉淀物制備依 諾肝素鈉時，在醇沉步驟即可去除硫酸根，而專利中使用樹脂去除硫酸根，步驟繁瑣。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于克服上述不足之處，提供一種從肝素鈉粗品直接生產依諾肝素 鈉的制備工藝，生產周期短、生產耗能低、產品質量高的制備方法。本發明以肝素鈉粗品為 原料，采用鹽解工藝進行預處理，然后加入過氧化氫，經離子交換樹脂吸附、洗滌、洗脫，最 后經超濾、凍干得肝素鈉精品，肝素鈉精品再經成鹽、酯化、解聚、氧化、醇沉、凍干處理得到 依諾肝素鈉。工藝簡單易行，適于工業化規模生產。
[0005] 下面對本發明方法進行以下具體描述：
[0006] 一種由肝素鈉粗品生產依諾肝素鈉的方法，該方法包括以下步驟：
[0007] 1)肝素鈉精品的制備：肝素鈉粗品用純化水溶解后加入氯化鈉，同時調節pH值為 8. 5?9. 0,進行鹽解，鹽解液離心，得肝素鈉預處理液；所得肝素鈉預處理液溫度降至28? 32°C，加入雙氧水，然后加至強堿型陰離子交換樹脂柱中吸附、洗滌、洗脫，收集肝素鈉洗脫 液；洗脫液調節PH值至5. 5?6. 0后經超濾、凍干得到肝素鈉精品；
[0008] 2)成鹽：將肝素鈉精品溶于純化水制成肝素鈉精品水溶液，將芐索氯銨溶于純化 水制成芐索氯銨水溶液，將兩種溶液以1 : 2?3 : 4的體積比混合后在室溫進行反應，反 應結束后離心，洗滌沉淀物、干燥得肝素季銨鹽；
[0009] 3)酯化：將肝素季銨鹽用二氯甲烷溶解后加入氯化節，在30?35°C下進行酯化， 酯化結束后冷卻至室溫，加入甲醇沉淀，分離沉淀并用甲醇洗滌、干燥得肝素芐酯；
[0010] 4)解聚：肝素芐酯用水溶解，向溶液中加入氫氧化鈉，在50?60°C下進行解聚反 應，反應結束加入甲醇沉淀，分離沉淀得肝素解聚產物；
[0011] 5)氧化：肝素解聚產物用純化水溶解，調節pH為8. 5?10. 0,加入雙氧水進行氧 化脫色；
[0012] 6)醇沉、凍干：將氧化脫色后的溶液用甲醇沉淀，分離沉淀，沉淀用純化水溶解后 凍干得依諾肝素。
[0013] 其中步驟1)中所述純化水，純化水加入體積和肝素鈉粗品重量的比為8?IOml/ g ;所述氯化鈉加入量和純化水用量體積的比為1/100?2/100g/ml ;鹽解溫度為50°C? 60°C，鹽解時間為2?3小時。
[0014] 其中步驟1)中所述雙氧水，加入量為肝素鈉預處理液體積的1 %?2%，為體積與 體積比。
[0015] 其中步驟1)中所述強堿型陰離子交換樹脂為0C1074或FPA-98。
[0016] 其中步驟1)中所述吸附，吸附速度為每小時0. 05?0. 06倍樹脂柱體積（0. 05? 0. 06BV/h);所述洗滌，洗滌所用溶液為5. 5 %?6. 0 %的氯化鈉溶液，洗滌速度為每小時 0.5倍樹脂柱體積（0.5BV/h);所述洗脫，洗脫所用溶液為12%的氯化鈉溶液，洗脫速度為 每小時0. 05?0. 06倍樹脂柱體積（0. 05-0. 06BV/h)。
[0017] 其中步驟2)中所述肝素鈉精品水溶液是按每克肝素鈉精品加入10_12ml純化水 溶解所得，芐索氯銨水溶液是按每克芐索氯銨加入8?IOml純化水溶解所得；成鹽反應時 間為1?2小時。
[0018] 其中步驟2)中所述干燥為減壓干燥，溫度50 °C?55 °C，真空度 為-0? 1?-0? 09Mpa，干燥時間40?60小時。
[0019] 其中步驟3)中二氯甲烷用量為每克肝素季銨鹽加入3?5毫升二氯甲烷，氯化芐 加入量為每克肝素季銨鹽加入1毫升氯化芐；酯化時間為25?30小時；所述干燥是指干燥 溫度為40°C?45°C的減壓干燥，真空度為-0. 1?-0. 09Mpa，干燥時間10小時?15小時。 [0020] 其中步驟4)中所述肝素芐酯用20倍水溶解，即按每克肝素芐酯加入20ml水溶 解，氫氧化鈉用量為肝素芐酯重量的8?10%，解聚時間為1?1. 5小時。
[0021] 其中步驟5)中所述雙氧水用量體積為純化水體積的1 %?1. 5%。
[0022] 其中步驟6)中加入甲醇在溶液中濃度為75%?80%。
[0023] 本發明以肝素鈉粗品為原料，首先通過步驟1)得到肝素鈉精品。肝素鈉粗品通過 鹽解使蛋白和肝素鈉分離，并離心去除雜質。獲得的肝素鈉預處理液中加入1%?2%的雙 氧水，在樹脂吸附時同時氧化，在樹脂純化時同時脫色。在離子交換時采用梯度洗脫工藝， 可以除去蛋白質、核酸、類肝素等雜質，且一步完成除雜脫色。與現有肝素鈉精制工藝比較， 可免除多次氧化、多次醇沉步驟，耗能低，不使用有機溶劑，經濟環保。制備得到的肝素鈉精 品進一步用于依諾肝素鈉的生產，可以有效保證依諾肝素鈉的產品質量。
[0024] 在從肝素鈉精品制備依諾肝素鈉的工藝部分，經成鹽、酯化、解聚得到肝素解聚物 后，只需一次氧化、醇沉，凍干即可得到依諾肝素鈉，產品質量符合歐洲藥典標準和美國藥 典標準。
[0025] 本發明具有的有益效果：
[0026] 1、肝素鈉精品制備工藝簡潔。離子交換步驟中，肝素鈉預處理液中加入雙氧水，在 樹脂吸附時同時氧化，在樹脂純化時同時脫色；在離子交換時采用梯度洗脫工藝，可以除去 蛋白質、核酸、類肝素等雜質，且一步完成除雜脫色。與現有工藝比較，減少了多次氧化、多 次醇沉步驟，耗能低，不使用有機溶劑，具有重要的經濟價值。
[0027] 2、制備得到的肝素鈉精品進一步用于依諾肝素鈉的生產，可以有效保證依諾肝素 鈉的產品質量。
[0028] 3、由該肝素鈉精品制備依諾肝素鈉的工藝也相應簡潔。得到肝素解聚產物后，只 需一次氧化、醇沉，凍干即可得依諾肝素鈉。
[0029] 4、制備得到的依諾肝素鈉產品質量符合歐洲藥典和美國藥典標準。
[0030] 5、本發明以肝素鈉粗品為原料，得到肝素鈉精品，再用于生產依諾肝素鈉，整個制 備工藝簡潔，生產周期短，且能從源頭和工藝有效保證依諾肝素鈉的產品質量。 具體實施例
[0031] 下述實施例僅用于闡述實現本發明的方法，不應理解為對本發明的限制，所有基 于本發明的思路作出的修改和變化都應歸于本發明的保護范圍。
[0032] 本發明所使用的肝素鈉粗品為華北制藥華坤河北生物技術有限公司所制；雙氧水 (市售，30%含量）、氫氧化鈉、氯化鈉、芐索氯銨、二氯甲烷、氯化芐、甲醇、乙醇等為市售； 離子交換樹脂0C1074為德國朗盛公司產品、FPA-98為美國羅門哈斯產品。
[0033] 實施例1
[0034]取肝素鈉粗品1公斤，用8L純化水溶解，加入80g氯化鈉，升高溫度至50°C，同時 用lmol/L氫氧化鈉溶液調節pH值為8. 5,在此條件下鹽解2小時，鹽解液離心得肝素鈉預 處理液。將肝素鈉預處理液溫度降至28°C，加入雙氧水，其體積為肝素鈉預處理液的1 %， 攪拌均勻后加至裝有15L 0C1074樹脂的樹脂柱中進行吸附，控制吸附速度為0. 05BV/h， 吸附完畢后的樹脂先用5. 5%氯化鈉溶液洗滌，流速0. 5BV/h，洗滌至吸光度A26tlnmS 0. 20、 A28tol彡0. 20時，用12%氯化鈉溶液洗脫，洗脫速度0. 05BV/h，檢測下柱液折光，當折光大于 5. 5時開始收集洗脫液，約收集1BV。收集的洗脫液用2mol/L鹽酸溶液調節pH為5. 5,經超 濾、凍干得肝素鈉精品340g。肝素鈉精品用10倍水（3. 4L)溶解后與芐索氯銨水溶液（680g 溶于6. 8L水）混合，室溫進行反應1小時，反應結束后離心，用水洗滌沉淀物，然后干燥得 肝素季銨鹽1020g (控制干燥溫度55°C，真空度-0. IMpa，干燥時間40小時）；肝素季銨鹽 用3倍（3060ml)二氯甲烷溶解后加入1020ml氯化節，在30°C下進行酯化，酯化25小時后 結束，冷卻至室溫，加入甲醇沉淀，分離沉淀并用甲醇洗滌，干燥得肝素芐酯（控制干燥溫 度為40°C，真空度-0. 092Mpa，干燥時間15小時）；肝素芐酯用20倍水溶解，加入肝素芐酯 重量8%的氫氧化鈉，50°C下進行解聚反應1. 5小時，反應結束加入甲醇沉淀，分離沉淀為 肝素解聚產物；肝素解聚產物用純化水溶解，用lmol/L氫氧化鈉溶液調節pH為8