一種牽牛子及其炮制品多糖提取物的制備方法及用圖
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種牽牛子及其炮制品多糖提取物的制備方法及用途，從屬中藥及天然藥物領域。該多糖提取物具有抗氧化活性，可制備成天然抗氧化劑，用于預防治療由氧化自由基引起的各種疾病，例如常見的癌癥、糖尿病、動脈硬化、心血管系統疾病、免疫功能的降低、老年癡呆、關節炎、白內障等。
【背景技術】
[0002]牽牛子(黑丑，白丑,二丑)，系旋花科植物裂葉牽牛(Pharbitis nil)或圓葉牽牛(Pharbitis purpurea)的種子,味苦性寒有毒,歸肺、腎、大腸經。生牽牛子偏于逐水消腫和殺蟲。炒牽牛子(炮制品)可使毒性大大降低，使瀉下作用緩和，功效偏于消痰滌飲和消食導滯，同時易于粉碎和煎出。現代研究發現牽牛子中的化學成分以牽牛子苷(樹脂苷類)、有機酸、脂肪油為主，尚有少量的蒽醌、二萜類成分。近幾年來的研究大都集中于牽牛子苷、有機酸類成分上，普遍認為牽牛子苷(樹脂苷類)為牽牛子的重要藥效物質基礎，而對牽牛子及其炮制品多糖的研究未見報道。本發明通過深入的化學、體外藥效學研究，發明了一種制備牽牛子及其炮制品多糖的方法，該方法操作簡便，經濟環保，且能得到較高純度和含量的多糖組分；同時首次發現牽牛子及其炮制品多糖具有抗氧化活性，可制備成天然抗氧化劑，用于預防治療由氧化自由基引起的各種疾病，如常見的癌癥、糖尿病、動脈硬化、心血管系統疾病、免疫功能的降低、老年癡呆、關節炎、白內障等。這與牽牛子以往研究中牽牛子苷(樹脂苷類)、有機酸類藥效物質基礎的研究是完全不同的。
【發明內容】
[0003]本發明主要目的是提供一種具有抗氧化活性的牽牛子及其炮制品多糖提取物。
[0004]本發明另一個目的是提供一種上述牽牛子及其炮制品多糖提取物的制備方法，牽牛子及其炮制品多糖提取物中總多糖的含量占各自提取物重量的百分比不低于70%，糖醛酸含量不低于9%。
[0005]本發明另一個目的是將上述牽牛子及其炮制品多糖提取物制成各種劑型的天然抗氧化劑，用于預防治療由氧化自由基引起的各種疾病，如常見的癌癥、糖尿病、動脈硬化、心血管系統疾病、免疫功能的降低、老年癡呆、關節炎、白內障等。
[0006]本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的:
[0007]—種牽牛子及其炮制品多糖提取物的制備方法，其特征在于:牽牛子藥材及其炮制品粉碎后，經過熱水回流或超聲水提取、醇沉、離子交換層析去除蛋白和色素，透析、凍干后制成較高純度的牽牛子多糖提取物。
[0008]一種制備上述牽牛子及其炮制品多糖提取物的方法，其包括以下具體步驟:
[0009](I)將牽牛子及其炮制品粉碎；(2)用熱水回流或超聲水提取，過濾，收集濾液，濃縮；(3)在攪拌下向濃縮液中緩慢加入乙醇進行醇沉，靜置，離心得沉淀；(4)沉淀分別用95%乙醇、丙酮和無水乙醇依次洗滌；(5)洗滌后的多糖沉淀加蒸餾水溶解透析，上弱酸弱堿型陰、陽離子交換樹脂柱，去除多糖中的色素和蛋白質；(6)所得洗脫溶液經透析、凍干后制成牽牛子及其炮制品多糖提取物。
[0010]為了達到更好的提取效果，步驟(I)中將牽牛子及其炮制品粉碎，過20目篩；步驟
(2)中用3?10倍重量的蒸餾水熱回流提取或超聲輔助水提取，提取次數為2?4次，每次提取時間為2?4h，過濾合并濾液，后將濾液濃縮至藥材0.2?1.0體積；步驟(3)中在攪拌下向濃縮液中緩慢加入90?95%乙醇，使乙醇濃度達到80%，離心得沉淀；步驟(4)中將沉淀依次用2?4倍重量的95%乙醇、丙酮和無水乙醇分別洗滌；步驟(5)中的沉淀以2?5倍重量的蒸餾水復溶透析；步驟(5) (6)中用3.5 X 13Da?1.2 X 14Da的透析袋透析脫鹽，透析時間為24?72h。
[0011]將從牽牛子及其炮制品中制備得到的多糖，用蒸餾水溶解后，經離子交換色譜柱DEAE-Cellulose (DE-52) DEAE-Sepharose F.F 進行分離，分別用 O ?Imol / L NaCl 溶液梯度洗脫，自動部分收集器收集洗脫液，經苯酚硫酸法檢測合并，選擇以下葡聚糖凝膠柱進行進一步純化:Sephadex G50> Sephacryl S100、Sephacryl S200> Sephacryl S300 和Sephacryl S400等(采用去離子水洗脫)。本發明牽牛子及其炮制品多糖提取物中總多糖的含量占各自提取物重量的百分比不低于70%，糖醛酸含量不低于9%，經以上步驟進一步純化可以得到牽牛子及其炮制品多糖單體。
[0012]所述的牽牛子及其炮制品，經回流提取或超聲提取，所得到的多糖提取物，對ABTS和DPPH自由基均具有較強的清除作用，提示其具有明顯的體外抗氧化活性。牽牛子及其炮制品多糖提取物可制備成天然抗氧化劑，用于預防治療由氧化自由基引起的各種疾病，例如常見的癌癥、糖尿病、動脈硬化、心血管系統疾病、免疫功能的降低、老年癡呆、關節炎、白內障等。
[0013]本發明牽牛子及其炮制品多糖提取物可以加入制備不同劑型時所需的各種輔料和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑后，以常規的中藥制劑方法制備成任何一種適宜的臨床制劑，例如可以是注射劑(粉針、凍干粉針、水針、輸液等)、口服制劑(片劑、口服液、顆粒劑、膠囊劑、軟膠囊或滴丸)等。
【附圖說明】
[0014]圖1:苯酚硫酸法標準曲線(以葡萄糖為標準品)
[0015]圖2:硫酸咔唑法標準曲線(以半乳糖醛酸為標準品)
[0016]圖3:牽牛子多糖B1-B6過離子交換柱層析苯酚硫酸法描點圖
[0017]圖4:牽牛子多糖B2的紅外光譜圖
[0018]圖5:牽牛子多糖B3的紅外光譜圖
[0019]圖6:牽牛子多糖B4的紅外光譜圖
[0020]圖7:牽牛子多糖B5的紅外光譜圖
[0021]圖8:牽牛子多糖B6的紅外光譜圖
[0022]圖9:經回流或超聲水提取，牽牛子及其炮制品多糖對ABTS自由基的清除作用
[0023]圖10:經回流或超聲水提取，牽牛子及其炮制品多糖對DPPH自由基的清除作用
[0024]圖11:牽牛子多糖提取物及各組分對ABTS自由基的清除作用
[0025]圖12:牽牛子多糖提取物及各組分對DPPH自由基的清除作用
【具體實施方式】
[0026]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0027]實施例1
[0028]取牽牛子原藥材3kg，粉碎后，過20目篩，加蒸餾水8倍量，回流提取2次，每次提取時間為2h，過濾合并濾液，后將濾液濃縮至藥材I倍體積，在攪拌下向濃縮液中緩慢加入95%乙醇，使乙醇濃度達到80%，靜置過夜，3000rpm / min離心，沉淀依次用4倍量95%乙醇、丙酮和無水乙醇分別洗滌，洗滌后的多糖沉淀加蒸餾水溶解裝入截留量為3.0X 13Da的透析袋中透析48h,上弱酸弱堿型陰、陽離子交換樹脂柱(Amberlite FPA90C1+AmberIiteIRC84)，去除多糖中的色素和蛋白質，用截留量為3.5X103Da的透析袋透析48h，冷凍干燥，得牽牛子多糖提取物。
[0029]實施例2
[0030]取牽牛子原藥材3kg，粉碎后，過20目篩，加蒸餾水8倍量，超聲提取2次，每次提取時間為2h，過濾合并濾液，后將濾液濃縮至藥材I倍體積，在攪拌下向濃縮液中緩慢加入95%乙醇，使乙醇濃度達到80%，靜置過夜，3000rpm / min離心，沉淀依次用4倍量95%乙醇、丙酮和無水乙醇分別洗滌，洗滌后的多糖沉淀加蒸餾水溶解裝入截留量為3.0X 13Da的透析袋中透析48h,上弱酸弱堿型陰、陽離子交換樹脂柱(Amberlite FPA90C1+AmberliteIRC84)，去除多糖中的色素和蛋白質，用截留量為3.5 X 13Da的透析袋透析48h，冷凍干燥，得牽牛子多糖提取物。
[0031]實施例3
[0032]取牽牛子炮制品3kg，粉碎后，過20目篩，加蒸餾水8倍量，回流提取2次，每次提取時間為2h，過濾合并濾液，后將濾液濃縮至藥材I倍體積，在攪拌下向濃縮液中緩慢加入95%乙醇，使乙醇濃度達到80%，靜置過夜，3000rpm / min離心，沉淀依次用4倍量95%乙醇、丙酮和無水乙醇分別洗滌，洗滌后的多糖沉淀加蒸餾水溶解裝入截留量為3.0X 13Da的透析袋中透析48h,上弱酸弱堿型陰、陽離子交換樹脂柱(Amberlite FPA90C1+AmberliteIRC84)，去除多糖中的色素和蛋白質，用截留量為3.5 X 13Da的透析袋透析48h，冷凍干燥，得牽牛子多糖提取物。
[0033]實施例4
[0034]取牽牛子炮制品3kg，粉碎后，過20目篩，加蒸餾水8倍量，超聲提取2次，每次提取時間為2h，過濾合并濾液，后將濾液濃縮至藥材I倍體積，在攪拌下向濃縮液中緩慢加入95%乙醇，使乙醇濃度達到80%，靜置過夜，3000rpm / min離心，沉淀依次用4倍量95%乙醇、丙酮和無水乙醇分別洗滌，洗滌后的多糖沉淀加蒸餾水溶解裝入截留量為3.0X 13Da的透析袋中透析48h,上弱酸弱堿型陰、陽離子交換樹脂柱(Amberlite FPA90C1+AmberliteIRC84)，去除多糖中的色素和蛋白質，用截留量為3.5 X 13Da的透析袋透析48h，冷凍干燥，得牽牛子多糖提取物。
[0035]實施例5:多糖含量的測定
[0036]精密稱取葡萄糖標準品10mg，用蒸餾水配制葡萄糖標準溶液，濃度分別為0，0.00625,0.0125，0.025，0.05 和 0.1mg / mL。分別取上述溶液 1.0mL,加入 5 % 苯酚溶液1.0mL,搖勻后迅速加入5.0mL濃硫酸，充分混勻，置70°C水浴15min，室溫放置1min后，于分光光度計490nm處，測定吸光度。以吸光度為縱坐標，對應的葡萄糖濃度值(mg / mL)為橫坐標制作標準曲線(見附圖1)，建立葡萄糖濃度與吸光度的線性回歸方程:y=7.7578x+0.0316 (R2=0.9979)。每個樣品溶液取1.0mL,按上述方法測定吸光度，由回歸方程計算供試液中葡萄