一種從組分iv-2沉淀中提取人血白蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物制藥領域，尤其涉及一種從組分IV-2沉淀中提取人血白蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]白蛋白(albumin)是人血漿中含量最多的蛋白質，約45g/L，占血漿總蛋白的60 %，是臨床上常用的血容量擴張劑之一，血漿白蛋白主要有兩方面生理功能:①維持血漿膠體滲透壓，②與各種配體(ligands)結合，起運輸功能。
[0003]人血白蛋白分離工藝是由美國哈佛大學cohn教授研宄開發的一種低溫乙醇血漿分級技術，該技術通過多步調節低溫乙醇法的五大要素:PH值、溫度、乙醇濃度、蛋白濃度、離子強度來實現逐級分離血漿中的各種蛋白質，分離人血白蛋白的步驟分別為:組分I沉淀分離；組分11+111(或組分I+II+III)沉淀分離；組分IV-1沉淀分離；組分IV-2沉淀分離；組分V沉淀分離；組分V沉淀經過進一步純化得到最終產物人血白蛋白。上述步驟中分離出的組分IV-2沉淀，通常作為廢料經高壓滅菌后廢棄，由于分離沉淀的過程中，影響的因素很多，有一定量的白蛋白共沉于組分IV-2沉淀中而被一起廢棄，造成浪費，而目前白蛋白市場也存在長期供需緊張的局面。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種可節約成本、避免浪費的
[0005]從組分IV-2沉淀中提取人血白蛋白的方法。
[0006]本發明提供了一種從組分IV-2沉淀中提取人血白蛋白的方法，包括以下步驟:
[0007]步驟一:溶解組分IV-2沉淀
[0008]將組分IV-2沉淀用含氯化鈉和枸櫞酸鈉的水溶液完全溶解；
[0009]步驟二:分離組分IV-1沉淀
[0010]用醋酸-醋酸鈉緩沖液調節步驟一的組分IV-2沉淀的溶解液pH值至6.00?
6.30，將溫度降至-1.0?0.(TC，用乙醇調節乙醇終濃度至39?41%，用醋酸-醋酸鈉緩沖液或氫氧化鈉溶液調整PH值至6.00?6.30，調節懸液溫度至-6.0°C?_4.0°C，攪拌均勻，開始懸液壓濾，控制過濾壓力為O?0.3MPa，過濾速度為20?90kg/min，濾出液溫度為-5.5?-3.50C，懸液壓完后清洗回收，回收液并入上清液罐，收集組分IV-1上清液，組分IV-1沉淀高壓滅菌后廢棄；
[0011 ] 步驟三:分離組分IV-2沉淀
[0012]用醋酸-醋酸鈉緩沖液調節組分IV-1上清液pH值至5.70?5.90，用乙醇調節乙醇終濃度至41.5?42.5%，再用醋酸-醋酸鈉緩沖液或氫氧化鈉溶液調整pH值至
5.70?5.90，調節反應溫度至-7.0°C?-5.0°C，攪拌反應完全后按每100kg制品加入硅藻土 2.0?3.0kg和珍珠巖2.0?3.0kg，攪拌反應，開始懸液壓濾，控制過濾壓力為O?0.3MPa，過濾速度為20?90kg/min，濾出液溫度為-6.0?-4.0°C，懸液壓完后進行清洗回收，回收液并入壓濾上清液罐，收集組分IV-2上清液，組分IV-2沉淀高壓滅菌廢棄；
[0013]步驟四:分離組分V沉淀
[0014]用醋酸和乙醇混合液調節組分IV-2上清液的pH值至4.70?4.90，調節溫度至-9.0?-8.00C，攪拌使其反應，開始懸液壓濾，控制過濾壓力為O?0.3MPa，過濾速度為20?90kg/min，濾出液溫度為-8.5?-6.5°C，待懸液全部壓濾完后，收集組分V沉淀；
[0015]步驟五:組分V沉淀溶解、過濾
[0016]將收集的組分V沉淀用沉淀重量5?7倍的0.0?4.(TC的注射用水溶解，攪拌至沉淀完全溶解，用醋酸-醋酸鈉緩沖液調整PH值至4.50?4.70 ;調節溫度至0.0?
4.0°C;繼續攪拌使其反應得到溶解液，按每100kg溶解液加入硅藻土 1.0?2.0kg和珍珠巖1.0?2.0kg，攪拌，開始過濾，控制過濾壓力為O?0.3MPa，過濾速度為10?60kg/min，濾出液溫度為0.0?5.(TC，溶解液壓完后進行清洗回收，濾液用氫氧化鈉溶液調節pH值至6.50?7.30，過濾沉淀高壓滅菌廢棄，得到過濾液；
[0017]步驟六:超濾透析、濃縮
[0018]用膜規格為1KD超濾器將步驟五得到的過濾液濃縮至蛋白質含量為8?12%，用4?6倍體積的2?8°C注射用水連續等體積透析，再用氫氧化鈉溶液或醋酸-醋酸鈉緩沖液調整制品pH值至6.60?6.90，用注射用水稀釋控制最終蛋白質含量為20.0?50.0g/L ；
[0019]步驟七:加溫純化、過濾
[0020]將超濾后濃度為20.0?50.0g/L的蛋白溶液加溫至50.0?55.0°C，恒溫I?3小時，恒溫結束降溫至18?26°C，轉移至白蛋白精制罐，用醋酸-醋酸鈉緩沖液調節制品pH值至4.50?4.70，繼續降溫至0.0?0.5°C，用乙醇調節乙醇終濃度至11?13%，調節最終溫度至-3.5?-2.5°C，繼續攪拌反應，反應完全后按每100kg懸液加入珍珠巖1.0?
2.0kg，攪拌，開始過濾，控制過濾壓力為O?0.2MPa，過濾速度為10?60kg/min，濾出液溫度為-3.4?-2.(TC，懸液壓濾完進行清洗回收，用氫氧化鈉溶液調節過濾上清液PH值至
6.60?6.90，調節最終溫度至-3.0?-2.0°C ;
[0021]步驟八:超濾透析、濃縮、配制
[0022]將步驟七得到的pH調節后的蛋白液經超濾濃縮至蛋白質含量為10?14%，然后依次進行連續等量透析，濃縮蛋白濃度至20.0?21.0%，按每克蛋白質加入0.15?0.18mmol辛酸鈉的比例加入辛酸鈉，用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調整最終pH值至6.50?
7.30，再進行59.5?60.5°C恒溫8?12小時巴氏病毒滅活和除菌分裝，即可得到人血白蛋白半成品。
[0023]所述步驟一中是用8?10倍重量的0.0?4.0°C的含0.8?0.9%氯化鈉和含0.6?0.8%枸櫞酸鈉的水溶液將組分IV-2沉淀溶解；其中含0.8?0.9%氯化鈉和含0.6?0.8%枸櫞酸鈉的水溶液的配制方法為:稱取8?9kg氯化鈉和6?8kg枸櫞酸鈉，然后加入800?900kg注射用水中攪拌至完全溶解，再補加注射用水至1000kg。
[0024]所述步驟二中，是采用40%平衡液800?100Kg對壓濾機進行清洗回收，所用的40%平衡液配制方法為??每1000kg注射用水加入_20°C以下的95% (v/v)乙醇563.3kg得到40% (v/v)的乙醇；然后在每1000kg 40% (v/v)乙醇中加入枸橡酸鈉3.66kg和氯化鈉
4.18kg ;用pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調節pH值至6.80-7.00 ;用-15°C冷媒調節溫度至-6.0 ?-5.0°C ；
[0025]所述步驟三中，是采用42%平衡液800?100Kg對壓濾機進行清洗回收，所用的42%平衡液配制方法為??每1000kg注射用水加入-20°C以下的95%乙醇607.9kg，得到42% (v/v)的乙醇，然后在每1000kg 42%的乙醇中加入枸櫞酸鈉3.67kg和氯化鈉
3.14kg ;用pH4.0醋酸-醋酸鈉緩沖液調節pH值至5.70-5.90 ;用-15 °C冷媒調節溫度至-7.0 ?-5.00C ；
[0026]所述步驟七中所用的乙醇為-4.0?-3.0°C的12%乙醇。
[0027]所述連續等量透析依次采用的溶劑為:2?8°C的4?6倍濃縮后制品重量的0.9% NaCl溶液和4?6倍濃縮后制品重量的0.5% NaCl溶液。
[0028]本發明采用溶解組分IV-2沉淀、分離組分IV-1沉淀、分離組分IV-2沉淀、分離組分V沉淀、組分V沉淀溶解、過濾、超濾透析、濃縮、加溫純化、過濾、超濾透析、濃縮和配制的步驟用來制備人血白蛋白，各步驟前后緊密相連、層層相扣，所生產得到的人血白蛋白半成品，蛋白質含量在20.1 %以上，純度不低于蛋白質總量的98.0%，pH值為6.5?7.3，殘余乙醇含量應不高于0.025g/100ml。
【附圖說明】
[0029]圖1為本發明原料組分IV-2沉淀生產工藝流程圖。
[0030]圖2為本發明提取人血白蛋白的生產工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0031]原料取自人血白蛋白分離工藝中分離得到的組分IV-2沉淀，可以采用最常規的人血白蛋白分離工藝，例如圖1所示的人血白蛋白分離工藝。
[0032]本發明提供了一種從組分IV-2沉淀中提取人血白蛋白的方法，工藝流程如圖2所示，包括以下步驟:
[0033]步驟一:溶解組分IV-2沉淀
[0034]將組分IV-2沉淀用8?10倍重量的0.0?4.0°C的含0.8?0.9%氯化鈉和含0.6?0.8%枸櫞酸鈉的水溶液攪拌6小時以上至完全溶解；
[0035]其中含0.8?0.9%氯化鈉和含0.6?0.8%枸櫞酸鈉的水溶液的配制方法為:稱取8?9kg氯化鈉和6?8kg枸橡酸鈉，然后加入800?900kg注射用水中攪拌至完全溶解，再補加注射用水至1000kg。
[0036]步驟二:分離組分IV-1沉淀
[0037]用pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液(醋酸-醋酸鈉緩沖液配制方法為:稱取1088.6g三水合醋酸鈉，倒入1L大立瓶中，用適量注射用水溶解，搖溶后，量取2288ml冰醋酸，加入到溶液中，加注射用水至l^L，混勻即得，下同)調節步驟一的組分IV-2沉淀的溶解液pH值至6.00?6.30，用-15°C冷媒將溫度降至-1.0?0.0°C，用_20°C以下95% (v/v)乙醇調節乙醇終濃度至39?41 % (v/v)，用pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液或0.5mol/L的氫氧化鈉溶液調整PH值至6.00?6.30，用_15°C冷媒調節懸液溫度至_6.0°C?_4.0°C,在攪拌速度為50?10rpm下攪拌反應2?3小時，用40%平衡液800?1200Kg對整個壓濾管路及壓濾機進行平衡降溫，設定吹掃時間20?40分鐘，用-7.5?-3.5°C預冷潔凈壓縮空氣吹干濾板(德國Begerow公司生產，型號:PX50，規格680*779mm)，使排放溫度達到-5.5?-3.5°C。開始懸液壓濾，控制過濾壓力為O?0.3MPa，過濾速度為20?90kg/min，濾出液溫度為-5.5?-3.5°C，懸液壓完設定吹掃時間30?60分鐘，用預冷潔凈壓縮空氣吹干濾板，用40%平衡液800?100Kg對壓濾機進行清洗回收，回收液并入上清液罐，設定吹掃時間30?150分鐘，再使用-7.5?-3.5 °C預冷潔凈壓縮空氣進行吹干，收集組分IV-1上清液，組分IV-1沉淀高壓滅菌后廢棄；
[0038]所用的40%平衡液配制方法為??每1000kg注射用水加入_20°C以下的95% (v/v)乙醇563.3kg得到40% (v/v)的乙醇；然后在每1000kg 40% (v/v)乙醇中加入枸櫞酸鈉
3.66kg和氯化鈉4.18kg ;用口財.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調節pH值至6.80-7.00 ;用_15°〇冷媒調節溫度至-6.0?-5.0°C ;
[0039]步驟三:分離組分IV-2沉淀
[0040]用pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調節組分IV-1上清液pH值至5.70?5.90，用-20°C以下95% (v/v)乙醇調節乙醇終濃度至41.5?42.5% (v/v)，加完乙醇后取樣檢測PH值并用pH4.0醋酸-醋酸鈉緩沖液或0.5mol/L氫氧化鈉溶液調整pH值至5.70?
5.90，用-15°C冷媒調節反應溫度至-7.0°C?-5.0°C，在攪拌速度為50?10rpm下攪拌反應2?3小時，反應完全后按每100kg制品加入娃藻土 2.0?3.0kg和珍珠巖2.0?
3.0kg，以攪拌速度為50?10rpm攪拌反應30分鐘，用42%平衡液800?1200Kg對整個壓濾管路及壓濾機進行平衡降溫，設定吹掃時間20?40分鐘，用-8.0?-4.(TC預冷潔凈壓縮空氣吹干濾板(德國Begerow公司生產，型號:PX50，規格680*779mm)，使排放溫度達到-5.5?-3.5°C，開始懸液壓濾，控制過濾壓力為O?0.3MPa，過濾速度為20?90kg/min,濾出液溫度為-6.0?-4.0°C，懸液壓完設定吹掃時間30?60分鐘，用預冷潔凈壓縮空氣吹干濾板，用42%平衡液800?100Kg對壓濾機進行清洗回收，回收液并入壓濾上清液罐，設定吹掃時間30?150分鐘，再使用-7.5?-3.5°C預冷潔凈壓縮空氣進行吹干，收集組分IV-2上清液，組分IV-2沉淀高壓滅菌廢棄；
[0041]所用的42%平衡液配制方法為??每1000kg注射用水加入-20°C以下的95%乙醇607.9kg，得到42% (v/v)的乙醇，然后在每1000kg 42%的乙醇中加入枸櫞酸鈉3.67kg和氯化鈉3.14kg ;用pH4.0醋酸-醋酸鈉緩沖液調節pH值至5.70-5.90 ;用_15°C冷媒調節溫度至-7.0?-5.0 °C ；
[0042]步驟四:分離組分V沉淀
[0043]用4mol/L醋酸和95 %乙醇混合液(每10kg注射用水，加入28.9L冰醋酸和TL 4kg乙醇)調節組分IV-2上清液的pH值至4.70?4.90，用-15 °C冷媒調節溫度至-9.0?-8.0 °C，在攪拌速度為50?10rpm下繼續攪拌反應2?3小時，用-9.0?-8.0°C的42% (v/v)乙醇1000?2000kg對整個壓濾管路及壓濾機進行平衡降溫，設定吹掃時間30分鐘