一種免疫調節多肽及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥及生物工程領域，涉及一種免疫調節多肽及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 現代營養學研究發現：人類攝食蛋白質經消化道的酶作用后，大多是以小肽形式 消化吸收，以游離氨基酸形式吸收的比例很小，進一步的試驗又揭示了小肽的吸收比游離 氨基酸的吸收更為迅速。肽營養作用的另一新認識是蛋白質在酶解過程中可以產生一些具 有特殊生理調節功能的生物活性肽。這些生物活性肽在調節胃腸道運動、調節免疫系統、 抗高血壓、抗菌、抗血栓、抗病毒、抗癌、清除自由基和促進礦物元素吸收等方面發揮著重要 作用。這些生物活性肽本身以非活性狀態存在于蛋白質氨基酸序列之中，當用適當的蛋白 酶進行體外水解或在胃腸道消化過程中以及食品加工過程中，它們的活性就被釋放出來。 盡管其它動物和植物蛋白質中也包含活性肽序列，但是乳蛋白是目前生物活性肽的主要來 源，對其研究最為深入。
[0003]Intein(內含肽）是存在于前體蛋白中的一段序列，在前體蛋白轉化為成熟蛋 白質的過程中，依靠自我剪切作用從前體蛋白中釋放出來，時間將兩端的蛋白質外顯肽 (extein)連接在一起,該過程即蛋白質剪接過程。在蛋白質純化過程中，Intein的自動切 割可避免了外源蛋白酶的加入以及后期對蛋白酶的清除步驟。
[0004]ELP(類彈性蛋白）可進行可逆相變，在低溫環境下的水溶液中，ELP呈無序結構 狀，均勻可溶分布于溶液中，但當溫度逐漸升高達到一定相變溫度時，它們會逐漸脫去結合 水，各ELP分子的疏水區互相接觸，最終發生相變聚集成團，這一相變具有典型的可逆性， 并且可以通過向溶液中加入鹽來加速啟動。將ELP作為融合標簽與目標蛋白融合表達時， 融合蛋白同樣具有這種相變特征。當攜帶ELP的整合蛋白發生聚集時，其他雜蛋白不發生 聚集，因此可以通過高速離心將密度高的聚集體融合蛋白與不發生聚集的雜蛋白分開，從 而達到純化目的。
[0005]ELP-Intein系統是充分利用ELP的自聚集以及Intein的自切割特征而構建的一 種非常獨特的蛋白質純化系統。將表達出的可溶性的"ELP-Intein-目標蛋白"三聯體經過 相變聚集進行純化，再誘導Intein發生自切割以釋放目的蛋白，再經過一次相變過程，將 附帶Intein的ELP標簽聚集體去除而得到純化的目標蛋白。運用ELP系統大大降低了蛋 白純化成本，為工業規模的應用提供了可能性。
[0006] 免疫活性肽是蛋白質中25種天然氨基酸以不同組成和排列方式構成的從二肽到 復雜的線性、環形結構的不同肽類的總稱。免疫活性肽具有能刺激多核淋巴細胞，促進淋巴 細胞分化和成熟，轉移免疫信息，增強機體免疫機能等一系列的生物學功能。大量試驗表明 乳蛋白中隱含有許多免疫調節多肽序列，這些免疫調節多肽對免疫系統具有重要的調節功 能。我們借助超濾技術分離出母乳中小于IOKDa的多肽成分，進一步借助串聯質譜技術對 其具體組成進行鑒定分析。這些多肽是主要從人￠-酪蛋白（Homosapiensbetacasein, 基因Bank號：NM_001891)中斷裂下來的片段，天然存在于母乳中。現有技術中沒有對這些 片斷及其功能進一步研究的報道，為此，我們篩選了一些多肽進行深入的研究。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種免疫調節多肽。
[0008] 本發明的另一個目的是提供上述免疫調節多肽的制備方法。
[0009] 本發明還有一個目的是提供上述免疫調節多肽的應用。
[0010] 本發明的目的是通過下列技術方案實現的：
[0011] 一種免疫調節多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
[0012] 表達上述免疫調節多肽的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0013] 所述多肽的擴增引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，下游引物 的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
[0014] 所述免疫調節多肽的制備方法，該方法包括下列步驟：
[0015]a.構建權利要求1所述多肽的表達載體pET-EI-GFP;
[0016] b.pET-EI-GFP融合蛋白的誘導表達；
[0017]c.pET-EI-GFP融合蛋白的純化；
[0018] d.pET-EI-GFP融合蛋白的自動切割；
[0019]e.重組多肽的純化、收集。
[0020] 所述的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0021]a.構建權利要求1所述多肽的表達載體pET-EI-GFP:
[0022] 人工合成該多肽核酸序列，利用上述的上下游引物（SEQIDNO:3,SEQIDNO:4) 通過PCR技術擴增出含有BsrGI和HindIII酶切位點的該多肽核酸片段進行膠回收，回 收產物雙酶切后載入pET-EI-GFP載體；
[0023] b.pET-EI-GFP融合蛋白的誘導表達：
[0024] 1)測序正確的表達載體轉入感受態細胞BLR(DE3)，接種于含氨芐青霉素的LB培 養液培養；
[0025] 2)收集菌體，重懸后加入IPTG誘導pET-EI-GFP融合蛋白表達；
[0026]c.pET-EI-GFP融合蛋白的純化：
[0027] 誘導表達后的菌液沉淀PBS緩沖液重懸后，超聲破碎，離心，取上清液加熱進行相 變聚集，離心，棄上清液，沉淀用預冷的PBS緩沖液重懸，離心，取上清液再次加熱進行下一 輪相變聚集，離心，棄上清液，沉淀用切割緩沖液重懸；
[0028] d.融合蛋白的自動切割：
[0029] 切割緩沖液與蛋白混合后，開始自動切割過程，釋放重組多肽的目的蛋白；
[0030]e.重組多肽的純化、收集：
[0031] 切割過程結束，再次進行相變聚集，切割下的ELP-Intein標簽和未切割完全的融 合蛋白將轉變為沉淀，失去標簽的目的蛋白則保持可溶狀態存在于上清中；棄沉淀，將上清 液透析過夜后進行真空冷凍干燥即可。
[0032] 所述的制備方法，其中切割緩沖液的組成為0.585g/LEDTA和8. 368g/LBis-Tri 溶解于PBS緩沖液中，調節pH值至6. 5,高壓滅菌，4°C保存。
[0033] 所述的免疫調節多肽在制備促T淋巴細胞增殖的藥物中的應用。
[0034] 所述的免疫調節肽在制備奶制品添加劑中的應用。
[0035] 本發明有益效果：
[0036] 本發明提供的免疫調節多肽具有很強的促T淋巴細胞增殖作用，能夠用于制備促 T淋巴細胞增殖的藥物。
[0037] 本發明拋棄了傳統親和層析柱純化，采用ELP-Int