一種天然溶血磷脂酰膽堿的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于制藥工程技術領域，具體地說，涉及一種天然溶血磷脂酰膽堿的制備 方法。
【背景技術】
[0002] 溶血磷脂酰膽堿（Iysophosphatidylcholine簡稱LPC)是一種潤濕能力、乳化能 力、乳化穩定性等性能均優于普通磷脂的優良乳化劑且同時具有抗氧化性和抗菌性，在食 品、化工、醫藥等領域應用廣泛。在醫藥領域中高純度溶血磷脂酰膽堿（LPC> 98% )主要 作為脂質體的乳化劑使用，其乳化效果較磷脂酰膽堿更佳，是新型靶向制劑的關鍵輔料。高 純度的溶血磷脂酰膽堿作為合成磷脂的起始原料，應用前景廣闊。目前中國藥典收載的藥 用磷脂主要控制指標包括甘油三酯、游離脂肪酸、酸值、過氧化值等，另外甲氧基苯胺值是 過氧化物的再次氧化產物指標，在制劑中有嚴格控制，因此開發藥用溶血磷脂酰膽堿需要 嚴格控制上述關鍵指標。
[0003] 目前制備高純溶血磷脂酰膽堿的方法主要有化學合成、酸堿水（醇）解、酶水 (醇）解和物理分離等方法。
[0004] 化學合成法由于存在使用毒性較大的反應試劑導致所得產品色澤、氧化指標等不 符合藥用要求等問題，因此其產品在醫藥領域的使用受到很大的限制。酸堿水（醇）解法 由于催化劑對磷脂1位或2位酯鍵的水（醇）解專屬性差，難以控制水解反應程度。酶水 (醇）解法使用的磷脂酶或脂肪酶對反應條件要求苛刻且容易失活，價格昂貴。
[0005] 物理分離方法包括：超臨界萃取法、膜分離法、溶劑提取法、吸附法、柱層析等方 法。其中CO2超臨界萃取法只適合制備混合磷脂，所得產品溶血磷脂酰膽堿含量普遍偏低。 溶血磷脂酰膽堿與其他溶血磷脂的分子量較接近，目前膜分離技術尚不能完全分離分子量 相近的組分，要得到單一溶血磷脂酰膽堿仍存在困難。溶劑提取法是通過利用溶血磷脂酰 膽堿在兩相溶劑中的溶解度的差異達到富集純化的目的，對理化性質非常相似的各類磷脂 的選擇性較差。吸附法是一種較常用的純化方法，通過選擇不同理化特性的吸附劑對待吸 附原料液進行攪拌吸附，達到純化的效果，常見的吸附劑有：三氧化二鋁、硅膠等，該方法 難以制備高純度的溶血磷脂酰膽堿產品且控制其它磷脂等雜質的限度存在較大困難。
[0006] 硅膠柱層析法是另一種較常用的分離純化方法，固定相與待分離物質的比例、洗 脫溶劑種類和比例對柱層析的分離效果與除雜能力有巨大的影響，柱層析方法的溶劑及比 例選擇與產品本身的性質以及雜質性質有關。該方法雖常見，但能夠使產品純度高同時又 能符合藥用要求的方法未見報道。
[0007] 日本專利JP01311088A公開以甘油磷脂酰膽堿和酰氯為原料反應得到溶血磷脂 酰膽堿并通過硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為洗脫劑，得到溶血磷脂酰膽堿含量為90%? 95 %的產品；日本專利JP63091306A公開了一種以大豆磷脂為原料，經過丙酮脫油，磷脂酶 A2水解，硅膠柱層析，乙醇-水洗脫，溶血磷脂酰膽堿含量為87%、溶血磷脂酰乙醇胺含量 為6%的產品，上述兩篇專利技術為化學合成或酶改性法得到的產品為非天然溶血磷脂酰 膽堿，且雜質較高，氧化指標無法控制。
[0008] 日本專利JP03011086A公開了一種以雙棕櫚酰磷脂酰膽堿為原料，經過磷脂酶A2 水解，十八烷基鍵合硅膠（ODS)柱層析，氯仿-甲醇-水洗脫，溶血磷脂酰膽堿含量為99% 的產品；中國專利CN103131736A公開了以磷脂酰膽堿為原料經過加入蓖麻油提取物，經過 磷脂酶A2水解，丙酮沉淀，得到溶血磷脂酰膽堿含量為95. 4?99. 1 %的產品，上述兩篇專 利技術得到的產品為非天然溶血磷脂酰膽堿且不能有效控制氧化指標。
[0009] 以上報道的方法在產品雜質、氧化指標等方面均沒法控制，難以將上述技術方法 應用在醫藥領域。目前開發天然溶血磷脂酰膽堿的技術領域里，沒有專門針對控制過氧化 值、甲氧基苯胺值等理化指標的方法。溶血磷脂酰膽堿本身具有高不穩定性，開發該類產品 需要過度依賴于起始原料的新鮮度。受技術約束，國內天然溶血磷脂酰膽堿主要依賴進口， 不僅價格昂貴，供貨周期長，且不利于天然溶血磷脂酰膽堿產品市場的普及應用。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的在于提供一種天然溶血磷脂酰膽堿的制備方法。以大豆或蛋黃來源 的磷脂為原料，通過柱層析以三元混合溶劑為洗脫劑進行兩次洗脫，一步提高溶血磷脂酰 膽堿含量并且有效控制產品中雜質限度（磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺）和氧化指標（酸值、 過氧化值、甲氧基苯胺值），以滿足藥用磷脂的質量要求。
[0011] 本發明的技術方案：
[0012] 以大豆或蛋黃來源的磷脂為原料，加入多鹵代烷烴溶解，經過柱層析以多鹵代烷 烴-低碳醇-水所組成的三元混合溶劑進行兩次洗脫，干燥，得到天然溶血磷脂酰膽堿。
[0013] 所用原料為蛋黃磷脂或大豆磷脂。
[0014] 所用填料為硅膠或二醇基硅膠。
[0015] 所用填料與原料的比例為1:2?14:2(kg/kg)。
[0016] 所用的多鹵代烷烴包括二氯甲烷、三氯甲烷或二氯乙烷。
[0017] 所用的低碳醇包括無水乙醇、丙醇、異丙醇或正丁醇。
[0018] 第一次洗脫所用的三元混合溶劑包括多鹵代烷烴，低碳醇和水。其中多鹵代烷烴 占混合溶劑的比例為46. 8 %?60. 0 %，水占混合溶劑的比例為1. 5 %?3. 0 %，其余為低碳 醇。
[0019] 第二次洗脫所用的三元混合溶劑包括多鹵代烷烴，低碳醇和水。其中多鹵代烷烴 占混合溶劑的比例為30. 0 %?45. 3 %，水占混合溶劑的比例為2. 5 %?6. 0 %，其余為低碳 醇。
[0020] 方法所述第一次洗脫體積用量（V)與原料重量（W)比為3:1?18:1 (L/Kg)。
[0021] 方法所述第二次洗脫體積用量（V)與原料重量（w)比為10:1?60:1 (L/Kg)。
[0022] 本發明的有益效果：
[0023] (1)本發明在保證溶血磷脂酰膽堿含量符合要求的同時達到脫色、除雜（降低磷 脂酰膽堿、甘油三酯、游離脂肪酸等雜質限度）、降值（降低酸值、過氧化值、甲氧基苯胺值） 的效果。
[0024] (2)本發明所得到的溶血磷脂酰膽堿為動植物原料中含有的內源性物質，通過物 理過程獲得的天然磷脂產品，無人工化學修飾。
[0025] (3)本發明突破了現有同類專利技術所存在的技術瓶頸，從技術層面解決了降低 過氧化值、甲氧基苯胺值等理化指標的難題，大大減少了溶血磷脂酰膽堿產品對起始原料 新鮮程度的過度依賴。
[0026] (4)本發明對原料的處理量大，生產操作簡便，可商業化大生產得到天然來源的溶 血磷脂酰膽堿產品，有利于國內溶血磷脂酰膽堿市場的開發與普及。
【具體實施方式】
[0027] 以下實施例所得產品中溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、甘油三酯、 游離脂肪酸含量以及酸值、過氧化值等關鍵均按照中國藥典收載的磷脂檢測方法進行測 定，甲氧基苯胺值按照歐洲藥典8. 0版2. 5. 36方法測定。
[0028] 實施例1:
[0029] 取大豆磷脂原料1公斤，加入氯仿溶解配成原料液，填裝10公斤硅膠進行柱層析， 第一次以洗脫劑（氯仿52. 8%、乙醇44. 2%、水3.0%)洗脫18升，第二次再以洗脫劑（二 氯甲烷45. 3%、乙醇54. 0%、水2. 5% )洗脫60升收集洗脫液，經過真空濃縮，冷凍干燥得 到溶血磷脂酰膽堿產品，LPC轉移率為70. 3%，溶血磷脂酰膽堿純度為99. 5%，磷脂酰膽堿 未檢出、磷脂酰乙醇胺未檢出、甘油三酯、游離脂肪酸均符合規定，酸值為0.6,過氧化值未 檢出，甲氧基苯胺值為3. 8。
[0030] 實施例2:
[0031] 取大豆磷脂原料10公斤，加入二氯乙烷溶解配成原料液，填裝70公斤二醇基硅膠 進行柱層析，第一次以洗脫劑（二氯乙烷55. 0%、異丙醇42. 0%、水3. 0% )洗脫180升， 第二次再以洗脫劑（氯仿43. 0%、丙醇54. 0%、水3. 0% )洗脫560升收集洗脫液，經過真 空濃縮，冷凍干燥得到溶血磷脂酰膽堿產品，LPC轉移率為80. 9 %，溶血磷脂酰膽堿純度為 99. 1%，磷脂酰膽堿0.2%、磷脂酰乙醇胺未檢出、甘油三酯、游離脂肪酸均符合規定，酸值 為0. 5,過氧化值未檢出，甲氧基苯胺值為2. 9。
[0032] 實施例3:
[0033] 取大豆磷脂原料20公斤，加入二氯甲烷溶解配成原料液，填裝100公斤硅膠進行 柱層析，第一次以洗脫劑（二氯甲烷60. 0%、乙醇38. 5%、水1. 5% )洗脫200升，第二次再 以洗脫劑（氯仿35. 0%、正丁醇59. 0%、水6. 0% )洗脫400升收集洗脫液，經過真空濃縮， 冷凍干燥得到溶血磷脂酰膽堿產品，LPC轉移率為83. 3%，溶血磷脂酰膽堿純度為99. 4%， 磷脂酰膽堿0. 3%、磷脂酰乙醇胺未檢出、甘油三酯、游離脂肪酸均符合規定，酸值為0. 7， 過氧化值未檢出，甲氧基苯胺值為4. 0。
[0034] 實施例4:
[0035] 取大豆磷脂原料50公斤，加入二氯乙烷溶解配成原料液，填裝250公斤硅膠進行 柱層析，第一次以洗脫劑（二氯乙烷58.0%、乙醇40.0%、水2.0% )洗脫600升，第二次 再以洗脫劑（二氯乙烷45. 3%、丙醇49. 7%、水5. 0% )洗脫2250升收集洗脫液，經過真 空濃縮，冷凍干燥得到溶血磷脂酰膽堿產品，LPC轉移率為85. 8