改善的細菌膜蛋白分泌的制作方法
【專利說明】改善的細菌膜蛋白分泌
[0001] 本申請是2010年11月15日提交的題為"改善的細菌膜蛋白分泌"的PCT/ US2010/056680號發明專利申請的分案申請，原申請進入中國國家階段獲得的國家申請號 為 201080052575. 8。
【背景技術】
[0002] 優先權申請
[0003] 本申請要求于2009年11月17日提交的美國申請No. 61/261，768的優先權，將該 專利以引用的方式全文并入本文。
技術領域
[0004]
[0005] 本發明涉及使蛋白質分泌穿過細菌質膜的改良方法，該方法包括將絲狀噬菌體外 殼蛋白用于展示外源蛋白質包括可以為單體的、二聚體的或異型二聚體的或多聚體的蛋白 質（包括完整抗體或抗體片段，或其他二硫鍵鏈接的多聚體構建體）的變體的文庫，該方法 通過將突變型pelB或突變型ompA分泌信號與所述外源蛋白（exoprotein)構建體連接來 實現。
[0006] 關于本領域的討論
[0007] 絲狀噬菌體展示是一種廣泛使用的基于親和力選擇蛋白質的技術，因為在選擇過 程中每個噬菌體顆粒將編碼多肽的核酸與其外殼蛋白的N端融合連接在一起。M13噬菌體 編碼五種外殼蛋白，在噬菌體的一端具有大概五個拷貝的次要外殼蛋白pin和pvi，在噬 菌體的另一端具有相同數目的PVII和pix。噬菌體DNA由大概3000個拷貝的主要外殼 蛋白pVIII包封。盡管已經用M13的每種外殼蛋白實現了外源多肽的展示，然而pin和 PVIII仍是目前最常用的融合伙伴。使用該技術，已構建了肽、Fab、scFv和其他蛋白結合物 (protein binder)的文庫并且可用于各種應用，具有極大商業價值。
[0008] 由于pill外殼蛋白的長度和構象其較于其他蛋白質更受歡迎。pill次要外殼 蛋白是負責噬菌體感染進大腸桿菌中的402個氨基酸、42kD的蛋白質，其包括由柔性鉸鏈 連接的兩個結構域。與pinn端融合可系住離開噬菌體顆粒的所展示的蛋白質，從而減 少了其干擾所需的pin功能的能力并且進一步使配體能足夠接近進行結合。相比之下， pVII和pix是分別為33個和32個氨基酸的短螺旋蛋白質，在噬菌體表面緊密包裝。然 而，有報道描述了scFv文庫在pix上的展示（Gao，C.等人，ProcNatlAcadSciUSA 99, 12612-12616, 2002)和通過利用使不同多肽與pVII和緊密相鄰的pIX二者融合的能力 對Fv或Fab文庫進行異型二聚體展示（Gao等人，1999ProcNatAcadSci96:6025-6030 和JandaUS7078166)。展示pVII融合物的噬菌體也已有報道（Kwasnikowski等人， 2005.JImmunolMethods307:135)。使用雜交噬菌體載體或噬菌粒載體，可在噬菌體上 展示與pIX外殼蛋白融合的肽、Fab和其他蛋白質（W02009/085462、W02009/085464和 W02009/085468)。也已描述了一種備選的方法，在該方法中由噬菌體或噬菌粒載體編碼的 外源蛋白（exoprotein)不與外殼蛋白融合，而是通過二硫鍵鍵合共價連接至重新工程改 造的外殼蛋白pill和pIX(US6753136)。
[0009] 大腸桿菌為最廣泛用于產生重組蛋白質的宿主之一。然而，在回收正確折疊的蛋 白質的大部分產量方面往往存在問題。解決這些問題的一種方法是使重組蛋白質分泌進周 質空間或培養基中。分泌制備重組蛋白質具有若干優點，如簡化純化、避免蛋白酶攻擊和N 端Met延長，以及蛋白質正確折疊的幾率更好。
[0010] 在噬菌體蛋白質的DNA復制和表達后，M13和其他絲狀噬菌體在宿主細胞膜處裝 配。噬菌體結構蛋白轉運進膜內中是噬菌體裝配的關鍵步驟。在噬菌體展示的實踐中，已將 細菌信號肽廣泛用于構建體中來幫助融合蛋白轉運穿過膜，并且已經是實現某些類型的融 合蛋白的展示所關鍵的。來自胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erswiniacarotovora)的果膠裂解酶 B(pelB)的信號肽已廣泛用于增強使用細菌細胞產生蛋白質以及增強在噬菌體展示中產生 蛋白質-者。
[0011] 利用細菌宿主細胞以及以重組文庫形式，通過細菌培養或在噬菌體顆粒表面上展 示更多樣和復雜的蛋白質如二聚體蛋白質的能力在能夠進行對經修飾的和重新工程改造 的復雜蛋白質結構進行選擇方面是有利的。一直需要推進現有技術來產生高度有效的蛋 白質制備方法以及篩選復雜蛋白質的變體的高通量方法，所述復雜蛋白質的變體為例如人 IgG的變體，人IgG為通過分子間的二硫鍵連接的重鏈和輕鏈對（異型二聚體）的同型二聚 體。
【發明內容】
[0012] 本發明提供了用于外源蛋白質在細菌質膜中（例如在于細菌宿主中裝配的噬菌 體顆粒上）表達、轉運和裝配的改良方法，該方法通過摻入與編碼期望表達和/或展示的 肽或多肽序列的氨基酸序列的核酸有效融合的編碼突變型pelB信號序列的核酸來實現， 該突變型pelB信號具有序列MKYLLSTAAAGLLLLAAQPAMA，為（SEQIDN0:1)的P6S變體。 在本發明的一個方面，編碼突變型pelB信號的序列可以是其中位置16的堿基為胸腺嘧啶 核苷的突變型SEQIDN0:2。在本發明的另一個實施例中，所編碼的分泌信號為具有序列 MKKTAIAIAVPLAGFATVAQA的突變型ompA，其為野生型序列的A11P變體（SEQIDN0:3)。在 一個方面，編碼突變型ompA分泌信號的序列可以是其中位置31處的堿基為胞嘧啶核苷的 突變型SEQIDN0:4。在本發明的方法中，將SEQIDN0:1的分泌信號P6S用于增強蛋白質 在細菌細胞培養物中的轉運。
[0013] 本發明提供了用于蛋白質在噬菌體顆粒上多價展示的改良方法以及在噬菌體顆 粒上展示與噬菌體外殼蛋白融合的二聚體或多聚體蛋白質的手段。在一個實施例中，多價 展示為與噬菌體PVII或pix次要外殼蛋白的N端融合的外源蛋白的多價展示。本發明還 涵蓋兩種不同的外源蛋白在噬菌體顆粒上的同時表達和展示，其中第一蛋白與PVII融合 而第二蛋白與PIX融合，這通過將編碼分泌信號pelB的P6S變體（SEQIDNO: 1)的序列與 pIX或pVII融合蛋白（其為噬菌體或噬菌粒載體）的外源蛋白編碼區融合來實現。在一個 方面，與pVII或pIX融合的多肽可形成鏈間聯合以在噬菌體上形成更高級結構，如二聚體 或多聚體的pVII連接的蛋白質或者二聚體或多聚體的pIX連接的蛋白質，或者其中一個或 多個外源蛋白與一個噬菌體外殼蛋白融合且相同或不同外源蛋白與不同的噬菌體外殼蛋 白融合的二聚體或多聚體結構。多聚體蛋白質可在與噬菌體外殼蛋白融合的多肽鏈之間形 成二硫鍵，或通過與獨立編碼和表達的外源蛋白聯合而形成更復雜的結構。在二硫鍵鍵合 的二聚體結構的一個例子中，所形成的蛋白質包含具有鏈間二硫鍵和鏈內二硫鍵鍵合的結 構域的抗體Fc結構域，該抗體Fc結構域能與Fc受體、蛋白A或補體因子Clq結合。在一 個方面，由與多肽鏈融合的外殼蛋白形成的蛋白質結構還與抗體輕鏈聯合以形成全長IgG 分子。在另一個實施例中，兩條不同的多肽展示為pVII和pIX融合物，其中所述多肽可在 絲狀噬菌體上形成非共價或共價性質的鏈間聯合（association)以形成二聚體或多聚體 蛋白質結構。
[0014] 本發明提供了表達與選自pin、pvii、pviii或pix的外殼蛋白融合的外源蛋白 的噬菌體在培養物中增加的生長，這通過摻入與所述外源蛋白編碼區融合的選自SEQID N0:2和4的分泌信號編碼區或編碼SEQIDNO: 1或3的肽的序列來實現。
[0015] 本發明提供了一種可復制載體，其編碼至少一種融合蛋白，具有與編碼選自pin、 pVII、pVIII或pix的噬菌體外殼蛋白的序列融合的編碼外源多肽的核酸序列，其中編碼SEQIDN0:1的P6S變體或SEQIDN0:3的A10P變體的分泌信號編碼序列與所述外源蛋白 編碼序列融合。在本發明的一個實施例中，編碼所述蛋白噬菌體外殼蛋白融合物的載體包 括在編碼可被配體或抗體識別的蛋白質標簽、蛋白酶裂解位點或帶靜電區或能夠進行化學 綴合的區域（如賴氨酸殘基）的蛋白質之間插入的另外的序列。在一個方面，所述另外的 序列為HA序列（SEQIDN0:5)、Flag(SEQIDN0:6)區或六組氨酸（His6，SEQIDN0:7)。
[0016] 在使用本發明的分泌信號的另一個方面，將分泌信號用于構建噬菌體或噬菌粒載 體，其中在外源蛋白編碼序列中具有多樣化區（variegatedregion)，以用于展示變體蛋白 質的文庫。在一個優選的實施例中，融合蛋白的外源蛋白部分為抗體或其片段，并且如此形 成的文庫為抗體或抗體片段（如scFv或Fab)文庫。在本發明的一個方面，將變體分泌信 號用于成同型二聚體的多肽鏈（如Fc融合蛋白）的構建體文庫。在另一個實施例中，同型 二聚體結構可進一步與異型多肽相連以形成更復雜的結構。在一個方面，抗體重鏈多肽和 輕鏈多肽二者在單個噬菌體分子中的展示會導致功能性抗體分子在噬菌體顆粒表面裝配， 例如但不限于完整的IgG分子。包括在本發明中的是含有可復制載體和能夠在其表面展示 融合多肽為二硫鍵連接的二聚體蛋白質的噬菌體顆粒的宿主細胞。如此產生的文庫可展示 可用于組裝、篩選以及諸如本領域實施用于抗體組合物的選擇和改善之類的其他訊問性技 術（interrogativetechnique)的從頭文庫。
【附圖說明】
[0017] 圖1A-B為用于表達pVII融合蛋白的克隆盒的圖示（A)和用于pVII和pIX融合 蛋白的雙表達的克隆盒的不意圖（B)。
[0018] 圖2A-E示出了關于抗體與展示HA(A)、FLAG(B)、His-6(C)的噬菌體的特異性結 合，以及關于可溶性二聚體EGFR-Ig構建體與展示PHPEP190(D)的噬菌體的特異性結合 和鏈霉親和素與展示PHPEP97(E)的噬菌體的特異性結合的噬菌體EL