一種gRNA體外合成及活性檢測的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，涉及基因編輯相關的一種gRNA體外合成及活性檢測 的方法。
【背景技術】
[0002] 基因定點敲除技術通過對染色體上基因特異位點進行定點突變，使其功能喪失， 進而達到研宄其功能的目的。一些利用基因敲除技術創建的疾病動物模型對醫學研宄的發 展做出了重要貢獻。傳統的基因敲除技術于上世紀80年代末由Smithies等創立，通過同 源重組手段將構建的外源DNA片段插入并替換相應染色體上特定的區段，達到基因敲除的 目的。這一技術的應用使人類能夠有目的地研宄基因功能和與之相關的疾病之間的直接關 系。然而由于同源重組技術需要載體構建、ES細胞打靶、篩選、顯微注射、小鼠鑒定等一系 列較為復雜的操作步驟，并且成本較高、周期較長，大大限制了這一技術的應用。針對同源 重組的缺點，科學家一直在探索用其它更簡便的技術來實現基因敲除。先后發明了ENU隨 機突變、基因捕獲、ES細胞基因敲除細胞庫等方法和手段，但由于技術手段和操作成本的限 制，這些技術都不能完全替代傳統的同源重組技術。2009年以后出現了一系列新的基因編 輯技術，包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9,開創了基因敲除（敲入）新的時代。這些新基因 編輯技術作用原理相似，即通過核酸酶在目的基因的DNA雙鏈上制造切口，然后利用生物 體自身的修復機制以同源重組或者非同源末端連接的方式實現修復，進而達到基因失活的 目的。作為一種最新的基因編輯技術，CRISPR/Cas9技術是通過gRNA(又稱引導RNA，真核 生物中參與RNA編輯的具有與mRNA互補序列的RNA)識別特異的靶序列，同時引導Cas9 核酸酶在DNA的特異位點上制造切口，然后利用生物體自身的修復機制進行DNA修復。這 一過程中可能造成堿基改變，增加，缺失等突變現象，進而實現對目的基因的敲除與修飾。
[0003] CRISPR/Cas9系統的高效基因組編輯功能已被成功應用于多種生物，包括人類細 胞、斑馬魚、小鼠、大鼠、植物及細菌。眾所周知，生物體的一個性狀往往由多個基因共同決 定。傳統的基因敲除費時費力卻只能每次敲除一個相關基因，而CRISPR/Cas9系統其中一 個最重要的特點便是可在多個不同gRNA的引導下由Cas9核酸酶一次靶向敲除多個基因組 位點。與其他基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9系統具有其獨特的優勢：
[0004] 1、其RNA-DNA識別機制，避免了DNA甲基化造成的影響。
[0005] 2、與ZFN和TALEN相比，它有相同或更高的基因編輯效率，尤其在點突變方面優于ZFN或TALEN。
[0006] 3、設計簡單快速，無需重復構建核酸內切酶表達載體，適用于任何分子生物學實 驗室。
[0007] 當前基因編輯技術迅速發展，CRISPR/Cas9技術以其優勢將迅速推動基因組功能 的研宄。快速獲取目標gRNA并檢測驗證其活性將會為科學實驗贏得寶貴的時間，并進一步 推動這項技術的應用。常規獲取gRNA要構建表達載體，需要把gRNA的轉錄模板連接到載 體上，經過涂板、挑選單克隆、搖菌、提取質粒、測序驗證，最終還要酶切使質粒線性化才能 得到gRNA的體外轉錄模板，得到gRNA最少也需要3天的時間。本發明旨在迅速獲取gRNA的體外轉錄模板，并在轉錄后通過體外實驗驗證其活性及特異性。為后續轉染或顯微注射 篩選有效的gRNA節省了寶貴的時間。
【發明內容】
[0008] 本發明的一個目的是提供體外合成目標基因的特異gRNA的方法。
[0009] 本發明提供的方法，包括如下步驟：
[0010] 1)合成gRNA轉錄模板的上游引物（單鏈DNA)、gRNA轉錄模板的下游引物（單鏈 DNA)和gRNA保守片段（雙鏈DNA);
[0011] 所述gRNA保守片段的核苷酸序列為序列表中序列2 ;
[0012] 所述gRNA轉錄模板的上游引物從Y 方向為17啟動子部分片段、gRNA前 導片段和核心區域；
[0013] 所述17啟動子部分片段的核苷酸序列為序列表中序列3自5'末端第1-20位； [0014] 所述前導片段為目標基因的基因組DNA中位于PAM片段上游的20個核苷酸；所述 PAM片段為NGG，其中，N為A、T、C、G中任一個；
[0015] 所述核心區域的核苷酸序列為序列2自5'末端第1-13位，其為gRNA保守片段序 列中自5'末端第1-13位的核苷酸組成的DNA分子；
[0016] 所述下游引物的核苷酸序列為序列表中序列4 ;
[0017] 2)以所述gRNA保守片段為模板，用所述gRNA轉錄模板的上游引物和所述gRNA轉 錄模板的下游引物進行PCR擴增，得到的PCR產物為gRNA轉錄模板；
[0018] 3)將所述gRNA轉錄模板進行體外轉錄得到gRNA，即為目標基因的特異gRNA。
[0019] 上述方法中，
[0020] 所述目標基因為NKp46基因外顯子Exon3 ;
[0021] 所述PAM片段為GGG;
[0022] 所述上游引物的核苷酸序列為序列表中序列3。
[0023] 上述方法中，
[0024] 在所述步驟3)后還包括步驟4):體外檢測所述特異gRNA活性的步驟；
[0025] 所述體外檢測所述特異gRNA活性的方法包括如下步驟：將含有gRNA靶片段的 DNA分子、Cas9核酸酶和所述特異gRNA混合酶切，檢測酶切產物，若所述DNA分子被切開， 且酶切得到的兩個片段大小與所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小 一致，則所述特異gRNA有活性；若所述DNA分子不能被切開或酶切得到兩個片段大小與所 述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小不一致，則所述特異gRNA無活性 或無特異性；
[0026] 所述DNA分子中的gRNA靶片段既不在所述部分片段的正中央，也不在所述部分片 段的起始或者末端。這樣選擇的原因是為了避開剪切后，兩條片段不能分開或者雖然可以 分開但一條帶過小不易觀察，具體所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和所述gRNA 靶片段下游片段大小不一致，且均不為0。
[0027] gRNA靶片段上游片段為在基因組中gRNA靶片段的上游片段；
[0028] gRNA靶片段下游片段為在基因組中gRNA靶片段的下游片段。
[0029] 上述方法中，所述目標基因為NKp46基因外顯子Exon3 ;
[0030] 所述DNA分子為包含NKp46基因外顯子Exon3的部分片段，其核苷酸序列為序列 表中序列8 ;
[0031] 所述NKp46基因外顯子Exon3的gRNA轉錄模板的上游引物的核苷酸序列為序列 表中序列3。
[0032] 上述方法中，
[0033] 所述目標基因為NKp46基因外顯子Exon3 ;
[0034] 所述NKp46基因外顯子Exon3的gRNA轉錄模板的上游引物的核苷酸序列為序列 表中序列3。
[0035] 由上述的方法制備的gRNA也是本發明保護的范圍，本發明以NKp46基因外顯子 Exon3的gRNA為例，但不僅限于該基因的該gRNA的合成與檢測，利用該方法設計合成及檢 測的所有gRNA都是本發明的保護范圍。實施例為序列5所示的DNA分子轉錄得到的RNA。
[0036] 上述的gRNA在酶切目的基因中的應用也是本發明保護的范圍。
[0037] 本發明的另一個目的是提供一種體外檢測上述的特異gRNA活性的方法。
[0038] 本發明提供的方法，包括如下步驟：
[0039] 將含有gRNA靶片段的DNA分子、Cas9核酸酶和所述特異gRNA混合酶切，檢測酶切 產物，若所述DNA分子被切開，且酶切得到的兩個片段大小與所述DNA分子中所述gRNA靶 片段上游片段和下游片段大小一致，則所述特異gRNA有活性；若所述DNA分子不能被切開 或酶切得到兩個片段大小與所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小不 一致，則所述特異gRNA無活性或無特異性；
[0040] 所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和所述gRNA靶片段下游片段大小不一 致，且均不為0。
[0041] 上述方法中，所述DNA分子為包含NKp46基因外顯子Exon3的部分片段，其核苷酸 序列為序列表中序列8。
[0042] 所述gRNA靶片段上游片段大小為804bp;
[0043] 所述gRNA靶片段下游片段大小為493bp。
[0044] 本發明的第三個目的是提供成套DNA。
[0045] 本發明提供的成套DNA，包括上述的gRNA轉錄模板的上游引物，上述的gRNA轉錄 模