用于dna提取的方法和試劑盒的制作方法
【專利說明】用于DNA提取的方法和試劑盒
[0001] 本申請是申請號為200980113817. 7 (國際申請號為PCT/US2009/034143)、申請日 為2009年2月13日、發明名稱為"用于DNA提取的方法和試劑盒"的中國專利申請的分案 申請。 發明領域
[0002] 本教導一般涉及從生物材料中分離核酸，以使所述核酸與下游應用中的使用相適 應（compatiblewith)的方法。
【發明內容】
[0003] 在各種實施方式中，本教導涉及多羥基聚合物和洗滌劑用于將核酸與具有親水表 面的磁性顆粒結合以及將核酸從所述磁性顆粒釋放的用途。在一些實施方式中，提供了用 于從生物材料中分離DNA的試劑盒。
[0004] 本文所用的標題部分只是用于編排目的，不理解為以任何方式限制所描述的主 題。本申請中所引用的所有文獻和類似材料，包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍和 協議，不管此類文獻和類似材料的形式如何，都以全文通過引用明確并入本文，用于任何目 的。
【附圖說明】
[0005] 本領域技術人員將理解下文所描述的附圖只用于說明目的。附圖并無意以任何方 式限制本教導的范圍。
[0006] 圖1是說明如本教導的各種實施方式中所描述的DNA的分離和純化方法的示意 圖。
[0007] 圖2說明如實施例6中所描述的DNA分離和純化的DNA產率，其中按照實施例4 中所描述的方法，從細胞計數范圍為1562-50000的培養的Raji細胞分離基因組DNA。
[0008] 圖3說明如實施例7中所描述的DNA分離和純化的DNA產率，其中按照實施例4 中所描述的方法，從細胞計數范圍為3500-110000的培養的K562細胞分離基因組DNA。
[0009] 圖4說明如實施例13中所描述的從基材中分離和純化DNA后獲得的基因分型分 布（genotypingprofiles)，其中按照實施例11的方法從生物樣品中分離基因組DNA，并使 用Identifiler'H式劑盒進行處理，用于基因分型。
【具體實施方式】
[0010] 雖然結合各種實施方式來描述本教導，但并無意將本教導限制于此類實施方式。 相反，如本領域技術人員將理解的，本教導涵蓋了各種替代、修改和等同物。
[0011] 本說明書中所用的絕大多數詞語具有本領域技術人員所認為的那些詞語的含義。 本說明書中具體定義的詞語具有本教導上下文中提供的整體含義和如本領域技術人員通 常理解的含義。在詞語或短語的本領域所理解定義與本說明書中具體教導的該詞語或短語 的定義相沖突的情況下，應以本說明書為準。本文所用的標題只是為了方便起見，并不理解 為以任何方式進行限制。
[0012] 本文所用的"DNA"指本領域所理解的各種形式的脫氧核糖核酸，例如基因組DNA、cDNA、分離的核酸分子、載體DNA和染色體DNA。"核酸"指任何形式的一種或多種核酸分子、 DNA或RNA(核糖核酸）。本文所用的術語"分離的核酸分子"或"分離的核酸"指已從其天 然環境中脫離（remove)的核酸分子（任何形式的DNA或RNA)。分離的核酸分子的一些實 例為含于載體中的重組DNA分子；保持在異源宿主細胞中的重組DNA分子；部分或基本純 化的核酸分子；獲得自包含生物材料的法醫樣品和其它樣品的核酸分子，所述生物材料例 如血液、精液、唾液、皮膚組織等；以及合成的DNA分子。"分離"的核酸可以不含在取得所 述核酸的有機體的基因組DNA中天然位于所述核酸側翼的序列（即位于所述核酸5 '和3' 端的序列）。此外，"分離"的核酸分子（例如cNDA分子）當通過重組技術制備時，可以基 本不含其它細胞材料或培養基，或者當化學合成時，可基本不含化學前體或其它化學品。
[0013] "聚合酶鏈式反應"（或"PCR"）指一種技術，其中使用變性、用引物退火以及用DNA聚合酶延伸的重復循環來將靶DNA序列的拷貝數擴增大約106倍或更多。用于擴增核酸的 PCR方法涵蓋于美國專利Nos. 4, 683, 195和4, 683, 202,通過引用將其全文并入本文，用于 描述該方法。任何PCR的反應條件包括該反應的化學組分及其濃度、反應循環中使用的溫 度、反應的循環數目以及反應循環的階段的持續時間。
[0014] "PCR相適應的（PCR-compatible) "指任何組合物、溶液、化合物、試劑等，其與PCT 檢測中的后續使用相適應，且對酶促聚合酶鏈式反應是相對非限制性的。如通過PCR結果 與相關陽性和陰性對照的比較所證明的，PCR相適應的產品顯示相對最小地抑制或者不抑 制PCR擴增。PCR檢測可以包括但不限于DNA基因分型系統；用于DNA定量的TaqMan? 或SYBRK.色實時PCR檢測；多重PCR檢測，包括設計為對短串聯重復序列進行基因分型 的那些。
[0015] 本文所用的"擴增"指酶促增加特定核酸序列的量的方法。該擴增并不限于但是 通常由PCR來實現。
[0016] "聚合物"或"多種聚合物"指用于將核酸與具有親水表面的磁性顆粒結合，以及將 核酸從所述磁性顆粒釋放的可溶性多羥基聚合物。
[0017] 在本教導的一些實施方式中描述了方法，其中可以從樣品中分離（separated)和 /或分離（isolated)核酸分子，并且在一些實施方式中，其中從所述方法制備的產物為核 酸。在一些實施方式中，本教導的方法導致形成了包含分離的核酸的產物。
[0018] 在本教導的一些實施方式中，可以從含有生物材料的樣品中分離和/或分離核酸 分子，并且在一些實施方式中，從所述方法制備的產物為核酸。此類樣品的例子包括但不限 于血液和血斑（bloodstain)、唾液和唾液斑、頰細胞和頰拭子、精液和精斑、煙蒂以及口香 糖。
[0019] 在本教導的一些實施方式中描述了方法，其中可以用包含可溶性多羥基聚合物和 洗滌劑的起始溶液處理樣品，并加入可磁性吸引的顆粒，以便從所述樣品中回收核酸分子， 并且在一些實施方式中，通過施加磁場從樣品中回收核酸。在各種實施方式中，所述樣品可 以包括一種或多種游離核酸；細胞；生物材料，例如頰拭子、被沾染的織物等。在本教導的 其它實施方式中描述了方法，其中可以從樣品中分離核酸，包括以下步驟：用包含聚合物和 洗滌劑的起始溶液處理樣品；向處理的樣品中加入懸浮的可磁性吸引的顆粒；以及通過施 加磁場，分離經由聚合物附著于可磁性吸引的顆粒的核酸。此類方法可以進一步包括從可 磁性吸引的顆粒釋放核酸的步驟。此類方法還可以進一步包括在水溶液中洗脫核酸的步 驟。
[0020] 然后可將如此獲得的核酸用于任何的各種下游應用中，例如定量、檢測以及特定 核酸的基因分型或甚至生物物種的基因分型。可以通過例如PCR擴增進行這些分析。作為 一個實例，在法醫DNA分析中，可以從復合生物材料中獲得人的核DNA(nDNA)和/或基因 組DNA，然后使用PCR進行基因分型。作為另一個實例，DNA制劑可用于使用實時PCR系統 (如QuantifilerK)對人DNA、或者更具體的男人DNA進行定量，和/或使用系統（例如 AmpF/STR?試劑盒）進行常染色體或Y染色體短串聯重復基因座的基因分型。基于存 在于樣品中的DNA的量，可以選擇將產生用于特定分析所需的最佳結果的特定基因分型系 統。因此，為了最好地將核酸用于下游應用中，以高產率產生產品的方法，以及相對不含下 游應用（例如PCR)的抑制劑的方法均是特別合意的。
[0021] 作為一個實例，在獲取和處理過程中，典型的法醫證據樣品常常暴露于各種環境 傷害中，這可導致被起抑制PCR作用的化合物污染，并且其因此對基因分型或其它分析的 嘗試造成干擾。在DNA分離期間以及擴增之前去除此類抑制劑是合意的。
[0022] 本教導的各種實施方式涉及核酸的有效結合，例如基因組DNA按以下形式與磁性 顆粒（即，可磁性吸引的顆粒或珠子）結合：然后可以在適當的水性條件下將結合的核酸釋 放。因此，這些教導的實施方式使核酸（例如基因組DNA)能夠從各種不同類型的生物材料 中有效分離。此外，可以從少量或大量的生物材料中分離核酸（例如基因組DNA)，所述材料 通常在實驗室中處理，例如在基因分型分析中涉及的那些材料。
[0023] 這些實施方式和本教導的其它特征將從下文描述中變得更加明顯。
[0024] 核酸分離系統
[0025] 本教導的各種實施方式涉及系統，其順應