從菠蘿皮中分離純化菠蘿蛋白酶的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程中反膠束萃取技術領域，也涉及菠蘿皮的回收利用技術。
【背景技術】
[0002] 近年來，科學家們利用表面活性劑在溶液中形成的各種分子有序組合體(如膠束、 反膠束、微乳液、液晶以及囊泡等）作為反應介質或模板，有效地對納米粒子的大小和形貌 進行調控，其中作為微反應器的反膠束是在非極性溶劑中形成的，它特殊的納米空間一 "水池"能將一些親水性的物質，如酶和蛋白質等增溶于其中，為它們提供一個特殊的微環 境。
[0003] 菠蘿蛋白酶是典型的巰基蛋白酶，廣泛存在于菠蘿的果實、芽、葉、莖中，分子量為 33000,能分解蛋白質、肽、酯和酰胺。它水解蛋白的活性較木瓜蛋白酶高十倍以上，因此可 廣泛應用于食品、醫藥和化工領域。譬如在生物化工中可將其用于干酪、明膠、水解蛋白的 生產，在食品工業中將其作為一種食品添加劑，可使肉質嫩化、啤酒澄清；在醫藥工業中，由 于它能在生物體內溶解纖維蛋白和血凝塊，因此可以治療水腫及多種炎癥，并使患處迅速 溶痂，此外，菠蘿蛋白酶對正常組織無害，不影響植皮，適用于中小面積深度燒傷的治療。
[0004]目前，用于工業化生產、提取菠蘿蛋白酶的方法主要有三種：高嶺土吸附法、單寧 沉淀法、超濾濃縮法；但這三種方法不僅生產成本高昂、易造成環境污染、生產工藝和操作 復雜，而且所得酶活性也不足以滿足醫藥級別及食品中對酶活性要求較高的應用。
[0005] 另一方面，我國雖然菠蘿資源豐富，年產量在140萬噸以上，而在用于加工菠蘿罐 頭、果汁等食品上，采用的完全是菠蘿果肉部分，剩下的菠蘿皮、菠蘿莖等部分就被作為廢 棄物而扔掉，這樣不僅造成了資源的浪費，而且也污染環境。
[0006] 鑒于反膠束的獨特結構及其對酶的功能或者活性影響較小等特點，CTAB(十六烷 基三甲基溴化銨）/異辛烷/正丁醇/正己醇反膠束曾被用來從菠蘿皮中分離純化菠蘿蛋 白酶，但表面活性劑CTAB用量較大，為0. 055g/mL，可實際應用的萃取條件窄，所得菠蘿蛋 白酶的萃取效率和活性回收率較低，最佳萃取條件下，萃取效率和活性回收率分別為40% 和 78%。
【發明內容】
[0007] 本發明目的是提出一種從廢棄的菠蘿皮中分離純化菠蘿蛋白酶的方法，以提高菠 蘿產業的增值。
[0008] 本發明包括以下步驟： 1) 制備菠蘿蛋白酶粗提液：將干凈的菠蘿皮與pH值為6. 0的磷酸緩沖溶液混合于粉 粹機中粉粹，4°C下離心，取上清液，即粗酶液； 2)前萃取：將NaCl、NaBr或KBr含量為0. 05~0. 25 M、pH值為8.0?12的甘氨酸-氫 氧化鈉緩沖液與粗酶液混合后再與反膠束以等體積比混合振蕩后，經離心分離取上層有機 相；所述反膠束由十二烷基三甲基溴化銨（DTAB)、正己烷、正己醇和水混合組成；十二烷基 三甲基溴化銨在反膠束中的濃度為0. 〇〇8g/ml?0. 025g/ml; 3) 后萃取：將KBr、NaBr或NaCl濃度為 0? 25~1. 5M、pH值為 4. 2 ?6. 0 的HAC-NaAC 緩沖液或pH值為5. 0?8. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液與有機相等體積比混合振 蕩后，經離心分離取下層水相； 4) 冷凍干燥：將下層水相在壓強為50±2Pa、溫度為-60°C?_55°C下冷凍干燥，得到純 菠蘿蛋白酶。
[0009] 本發明前萃取是用反膠束萃取菠蘿蛋白酶粗提液，使菠蘿蛋白酶進入反膠束中， 離心分離后取有機相；后萃取是用后萃液(亦稱反提取劑）萃取有機相，使反膠束中的菠蘿 蛋白酶從反膠束轉移到水相中，離心分離后得到菠蘿蛋白酶溶液。
[0010] 本發明充分利用了廢棄的菠蘿皮，不但可以改善環境，同時也可提高菠蘿產業的 增值。本發明突破傳統提取和分離菠蘿蛋白酶的方法，實現從菠蘿皮中高效提取菠蘿蛋白 酶，保持菠蘿蛋白酶的活性，減少菠蘿蛋白酶的損失，提高菠蘿廢棄物的綜合利用，加快菠 蘿及其蛋白酶產業的發展。
[0011] 本發明采用單鏈的十二烷基三甲基溴化銨作為反膠束主成分，其用量小，十二烷 基三甲基溴化銨在反膠束中的濃度只占0. 〇〇8g/ml?0. 025g/ml，不但能減少對菠蘿蛋白 酶的污染，還可使菠蘿蛋白酶的提取效應達到最佳；萃取分離以后，反膠束相與水相分層明 顯，在萃取過程中保持了菠蘿蛋白酶的活性，減少了菠蘿蛋白酶的損失。萃取條件范圍廣， 操作過程簡單，提取工藝易于放大，萃取以后，菠蘿蛋白酶的萃取效率達到56%，活性回收率 達到95%，純化倍數達到1. 7。
[0012] 另外，本發明十二烷基三甲基溴化銨在所述反膠束中的濃度為〇.〇15g/ml? 0. 025g/ml。在此條件下的菠蘿蛋白酶萃取效率、活性回收率和純化倍數達到實際生產的較 佳要求。
[0013] 本發明反膠束中的助溶劑正己醇的存在一方面是為了配置得到穩定的反膠束，另 一方面可調控反膠束的體積和表面活性劑與酶的相互作用，從而促使酶由水相轉移至反膠 束相。優選的正己醇占正己烷和正己醇混合總體積的9. 5?11. 1%。
[0014] 本發明所述pH值為6. 0的磷酸緩沖溶液中包含5mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉 (EDTA)，磷酸緩沖溶液的濃度為0. 04mol/L。乙二胺四乙酸二鈉（EDTA)具有活性保護劑和 抗氧化劑的作用，可保持菠蘿蛋白酶的活性。
[0015] 為了有利于菠蘿蛋白酶從菠蘿皮中被浸提出來，并可保持菠蘿皮中菠蘿蛋白酶的 活性，防止菠蘿蛋白酶的自身水解作用，通常磷酸緩沖溶液與菠蘿皮的混合質量比為1:1。
[0016] 所述前萃取中甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液的pH值為9.0?11。菠蘿皮中菠蘿蛋白 酶的等電點為9. 5,當水相pH值大于酶的等電點時，酶所帶電荷與反膠束內表面所帶電荷 相反。酶和表面活性劑之間的靜電吸引作用可使酶萃取到反膠束中。水相pH值也決定了 酶表面可電離基團的離子化程度。水相pH值越高，目標酶所帶負電荷越多，它和陽離子表 面活性劑之間的靜電吸引作用就越強，有利于酶的前萃取。因此為了提高菠蘿蛋白酶最佳 的萃取效率和活性回收率，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液的pH值為9. 0?11。
[0017] 適量鹽的存在可減少表面活性劑頭基間的靜電斥力，增強酶與表面活性劑頭基之 間的相互作用。但鹽的濃度過大，則會屏蔽表面活性劑和酶之間的靜電作用，不利于酶的提 取。本發明在前萃取中，NaCl、NaBr或KBr在pH值為8.0?12的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖 液中的濃度為0. 1 M。該離子強度對萃取效率、活性回收率和純化倍數的提高都具有較好的 貝獻。
[0018] 前萃取中，所述甘氨酸_氫氧化鈉緩沖液和粗酶液的混合體積比為24?50:1。待 提取粗酶液中酶的含量也是決定反膠束提取效應的一個重要因素。經研究發現在該條件 下，菠蘿蛋白酶可表現良好的活性回收率和萃取效率。
[0019] 為了提高萃取效率、活性回收率及純化倍數，后萃取中，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉 緩沖液的pH值優選為6.0?8.0。后萃取中，當pH值小于酶的等電點時，表面活性劑與酶 相互排斥，促使酶從反膠束內核中排出。因此緩沖液的pH值一定要小于菠蘿蛋白酶的等電 點9. 5。并且后萃取中，KBr或NaBr1濃度優選為0. 5M。
[0020] 后萃取中，優選pH值為4. 2?5. 0的HAC-NaAC緩沖液，其中KBr或NaBr濃度為 0. 5?1. 0M，或采用pH值為4. 2?5. 0的HAC-NaAC緩沖液中NaCl濃度為0. 25M兩種方案 都利于提高菠蘿蛋白酶萃取效率、活性回收率及純化倍數。
[0021] 本發明在后萃取中，HAC-NaAC緩沖液的pH值優選為4. 2,菠蘿蛋白酶萃取效率、活 性回收率及純化倍數可達到最大值。
【附圖說明】
[0022] 圖1為菠蘿蛋白酶萃取效率以及活性回收率、純化倍數與表面活性劑DTAB濃度的 變化關系圖。
[0023] 圖2為菠蘿蛋白酶萃取效率以及活性回收率、純化倍數與前萃取時甘氨酸-氫氧 化鈉緩沖液pH值的變化關系圖。
[0024] 圖3為菠蘿蛋白酶萃取效率以及活性回收率、純化倍數與后萃取時HAC-NaAC緩沖 液或磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的pH值的變化關系圖。
[0025] 圖4為菠蘿蛋白酶萃取效率以及活性回收率、純化倍數與反膠束中正己醇占正己 烷和正己醇混合比的變化關系圖。
[0026] 圖5為菠蘿蛋白酶萃取效率與前萃取時加入的三種鹽濃度的變化關系圖。
[0027] 圖6為菠蘿蛋白酶活性回收率與前萃取時加入的三種鹽濃度的變化關系圖。
[0028] 圖7為菠蘿蛋白酶純化倍數與前萃取時加入的三種鹽濃度的變化關系圖。
[0029] 圖8為菠蘿蛋白酶萃取效率與后萃取時加入的三種鹽濃度的變化關系圖。
[0030] 圖9為菠蘿蛋白酶活性回收率與后萃取時加入的三種鹽濃度的變化關系圖。
[0031] 圖10為菠蘿蛋白酶純化倍數與后萃取時加入的三種鹽濃度的變化關系圖。
[0032] 圖11為菠蘿蛋白酶萃取效率以及活性回收率、純化倍數與菠蘿蛋白酶粗提液稀 釋倍數的變化關系圖。
【具體實施方式】
[0033] 一、分離純化工藝： 1、反膠束配制： 稱取一定量的十二烷基三甲基溴化銨（DTAB)，并加入到按體積比11:1?4:1混合的正 己烷和正己醇的混合體系中，按(表面活性劑分子和水分子的摩爾比）=20:1加入蒸餾 水，然后用振蕩器充分振蕩至得到澄清透明的溶液，此即為反膠束。
[0034] 以此配成各反膠束中DTAB占比分別為0. 003g/ml?0. 035g/ml，且，正己醇占正己 烷和正己醇混合體積百分數8. 3%?20%。
[0035] 2、酶粗液的提取： a.預處理：將菠蘿皮在清水中洗凈，浙干，切成小段后置于-20°C冷凍保存備用。
[0036]b.粗酶液的抽提：解凍原料--菠蘿皮后，將菠蘿皮與相同質量的0. 04mol/L、 PH6.0磷酸(含5mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉（EDTA))緩沖溶液置于粉粹機中粉粹；之后 用四層紗布擠壓進行渣汁分離，得到的粗濾液在4°C下lOOOOrpm離心25min后，取上清 液，即粗酶液。
[0037] 3、前萃取： 按常規方法，用甘氨酸和氫氧化鈉配置50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH值范圍為8.0?12。再加入NaCl、NaBr或KBr，使甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中的NaCl、NaBr或KBr 濃度為〇?0.35M后，再以體積比10:1?50:1的比例加入粗酶液。
[0038]再將上述混合溶液與反膠束等體積混合，充分振蕩15min，在25°C，14000rpm下離 心45min，得到兩相，上層為反膠束相，下層為水相。
[0039] 4、后萃取： 后萃液配置：按常規方法，用醋酸和醋酸鈉配置10mMHAC-NaAC緩沖液，pH值范圍為 3. 6?6. 0 ;或用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配置10mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH值 范圍為5.0?8.0。或用NaCl、NaBr或KBr使HAC-NaAC緩沖液中的NaCl、NaBr或KBr濃 度為0.25?2.0M。或用NaCl、Na