一種歐洲鰻鱺肝臟細胞系及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種歐洲鰻鱺Anguilla)肝臟細胞系及其構建方法和應用，屬于海水魚類細胞培養技術領域。
【背景技術】
[0002]魚類細胞培養始于20世紀60年代，自Wolf等1962年建立第一個真骨魚類永久性細胞系——虹鱒生殖腺細胞系RTG-2以來，國內外已建立了 250余株魚類細胞系，有40余種病毒采用細胞培養分離成功，魚類胚胎干細胞培養的成功更是有力地促進了基因工程的發展。魚類研究實驗對于養殖場所、設備和水體環境的維持有較高的要求，以魚類培養細胞作為實驗模型，有著活體魚無法比擬的優點:(I)成本低，細胞系的維護不需要大型的養殖設備和大量的換水與充氣；(2)重復性好，實驗條件可以精確控制；(3)取樣、觀測簡便易行，利于進行大量樣本的分析。魚類體細胞系模型研究幾十年來發展迅速，已經廣泛應用于病原學、藥理學、生理學、環境毒理學、細胞生物學、腫瘤學以及資源保護等各方面，在病毒學研究中尤其具有重要的地位，被視為病毒性病原分離、鑒定和特性研究的基礎。
[0003]鰻鱺養殖業是我國水產業重要的支柱行業，其年產量約占世界總產量的2/3，單項產品出口值在水產品中位居榜首。歐洲鰻鱺(AnguiIla AnguiIla)屬鰻鱺目
鰻鱺科鰻鱺屬{Anguilla)，原產于大西洋，于 1993 年首次引入我國，并于同年實現配套飼料國產化；自引養成功以來，歐鰻養殖業迅速發展，90年代末歐洲鰻鱺年產量超過日本鰻鱺，成為我國最重要的養殖鰻鱺品種，其肉質細嫩，味美，富含蛋白質、多種維生素及不飽和脂肪酸，具有極高的營養價值，有“軟黃金”之稱。由于養殖業的迅速發展，養殖布局不合理、密度過大、水流不暢等問題普遍發生，加之時有投喂變質餌料和濫用藥物的狀況，導致魚體免疫力下降和水體污染，各類病害頻繁爆發，其中不乏病毒性病例，而當前已有的歐洲鰻鱺細胞系模型極少，遠不能滿足研究需要。
[0004]由于歐洲鰻鱺降河洄游的繁殖習性和復雜多變的生活史，其人工繁殖至今仍是未解的世界級技術難題；而歐鰻胚胎和低齡幼體的難以獲取，和被列為瀕危物種后對玻璃鰻進出口的限制，客觀上增大了歐洲鰻鱺體細胞系建立的難度，更加突顯出這一亟需填補的技術空白的重要性。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種歐洲鰻鱺肝臟細胞系及其構建方法和應用，以彌補現有技術和細胞模型庫的不足，并滿足對歐洲鰻鱺進行病原學分析和生理特性、功能基因組等研究的應用需要。
[0006]本發明所涉及的歐洲鰻鱺肝臟細胞系的構建方法，其步驟如下:
1)歐洲鰻鱺的試前準備:健康歐洲鰻鱺幼體黑仔鰻在潔凈海水中于室內暫養I?2周，期間不喂食餌料；
2)歐洲鰻鱺肝臟組織的獲取:將步驟I)準備好的仔鰻置于碎冰中行冰凍麻醉，至魚體對物理刺激應激行為消失為止；以2%碘酊棉球充分擦拭魚體表面去除黏液后，再以75%酒精棉球擦拭魚體表面2?3次，由側面剪開體壁，取出肝臟組織，置于(TC預冷并含青霉素及鏈霉素雙抗的滅菌無鈣鎂D-Hanks平衡鹽溶液中，清洗5?6次；
3)原代培養:將步驟2)得到的歐洲鰻鱺肝臟組織剪碎成0.5mm3?Imm3大小的組織塊，以步驟2)所述滅菌無鈣鎂D-Hanks平衡鹽溶液漂洗；用不含血清的L-15培養基潤濕培養瓶底面，將漂洗后的組織塊移入25mL培養瓶中，以0.3cm?0.5cm的間距均勻排列；倒置瓶身于20°C密閉培養6?8小時使組織塊貼壁后，在培養瓶中加入原代及早期傳代培養用完全培養液，緩慢翻正瓶身，使培養液浸潤組織塊，于20°C恒溫下啟動原代培養；
4)早期傳代培養:收集生長良好的原代培養物進行早期傳代培養，傳代前棄去培養液和脫落的組織塊，用0.25%胰酶潤洗細胞層，棄去，再加入0.25%胰酶消化細胞，待細胞呈收縮分離態勢時棄去胰酶，加原代及早期傳代培養用完全培養液中止消化，以彎頭滴管吹打培養物至細胞和組織塊大部分分散脫落，收集細胞和組織懸浮液，100rpm離心3分鐘，去除上清后用完全培養液重懸沉淀，依照細胞和組織塊數量以1:1?2:1的比例在27°C下進行富集化培養，重復以上步驟直至確認培養物連續數代無污染跡象，傳代后細胞能順利形成鋪滿瓶底的單層；
5)常規傳代培養:細胞能穩定形成單層后對其進行常規傳代培養，以顯微鏡法對培養細胞進行連續觀察，當細胞出現均勻的輕微堆疊現象時即行傳代，用0.25%胰酶潤洗細胞層，棄去，再加入0.25%胰酶消化細胞30秒至I分鐘，待上層細胞收縮變圓時棄去胰酶，力口入常規傳代培養用完全培養液，用彎頭滴管輕柔吹打至上層細胞脫落制成細胞懸液，將全部細胞懸液移入新瓶，于27°C恒溫下進行常規傳代培養；
6)細胞的凍存及復蘇:當細胞進入常規傳代培養階段后，對其分批進行液氮冷凍保存，凍存液組成為70%L-15、20%胎牛血清以及10%DMS0 ;復蘇細胞時，以37°C水浴迅速解凍樣品，吸出細胞懸液后與常規傳代培養用完全培養液混勻接種于培養瓶內，12小時后更換培液，去除未成活細胞和DMSO成分后繼續培養。
[0007]步驟3)和4)所述原代及早期傳代用完全培養液是以L-15培養基為基礎，含終濃度為15%的胎牛血清，終濃度為200U/mL的青霉素，以及終濃度為200 μ g/mL的鏈霉素的完全培養液。
[0008]步驟5)所述常規傳代培養用完全培養液是以L-15培養基為基礎，含終濃度為10%的胎牛血清，不含抗生素及其他營養添加物的完全培養液。
[0009]本發明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。
[0010]根據上述細胞系構建方法，建立了一株歐洲鰻鱺肝臟細胞系EL，該細胞系于2014年12月16日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏登記入冊編號為CCTCC N0:C2014239o
[0011]所述歐洲鰻鱺肝臟細胞系EL，該細胞系具有以下生物學特性:
O該細胞系為典型的成纖維細胞形態，在體外連續傳代60代仍可保持該形態特征。
[0012]2)該細胞系增殖能力強，存活時間長，在每周更換培養基一次的條件下體外生存期限可穩定達到70?90天，最長可超過150天，在體外連續傳代60代仍然保持該生理特征。
[0013]本發明還保護了所述的歐洲鰻鱺肝臟細胞系EL作為水產動物病毒宿主細胞的應用，取對數生長期的EL細胞，在維持性培養基環境下接種鰻鱺皰疹病毒HVA-1I，可產生典型的細胞病變(cytopathic effect , CPE)現象。
[0014]所述維持性培養基以L-15培養基為基礎，包含終濃度為2%的胎牛血清。
[0015]本發明的有益效果在于:
1)本發明的技術方案簡便易行，篩選條件簡單明晰，所用試劑均為魚類細胞培養中最常用的常規用品，無須添加任何特殊營養成分，從而保證了所構建的歐洲鰻鱺肝臟細胞系有廣闊的應用空間，有效填補了歐洲鰻鱺體細胞系模型建立的技術空白；
2)所構建的歐洲鰻鱺肝臟細胞系(EL)細胞生長旺盛，形態均一，為成纖維樣細胞，能連續傳代60代以上，且凍存復蘇后貼壁良好，生長穩定，能直接用于水產病毒學、歐洲鰻鱺細胞生物學特性及免疫抗病基因功能的研究，并已被證實對鰻鱺皰疹病毒敏感；
3)該構建方法操作簡單，重復性強，成本適中，也適用于其他歐洲鰻鱺體細胞系。
【附圖說明】
[0016]圖1:歐洲鰻鱺肝臟細胞原代培養光鏡照片:a&b、不同類型細胞從組織塊中遷出；c&d、細胞圍繞組織塊形成不同形態的生長暈。
[0017]圖2:歐洲鰻鱺肝臟細胞傳代培養光鏡照片:a、第2代EL細胞；b、第5代EL細胞；C、第11代EL細胞；d、第21代EL細胞；e、第41代EL細胞；f、第70代EL細胞。
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