一株馬胃葡萄球菌及其在降解重金屬離子中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種微生物及其在降解重金屬離子中的應用，特別涉及一株馬胃葡萄 球菌馬胃亞種菌株及其在重金屬污染中的應用，屬于微生物的檢測及應用技術領域。
【背景技術】
[0002] 土壤是地球生態環境的重要組成部分，是人類賴以生存的重要不可再生資源之 一，但是隨著人類經濟社會的發展。尤其是工礦業對自然界礦產資源的大量開發和利用，所 形成的礦業廢棄地高濃度重金屬污染是重要的環境污染物之一，加劇了土壤環境的日益惡 化。重金屬污染主要來源于工礦業的開采與加工、工業廢水、垃圾填埋、采礦、冶煉、煤燃燒、 電鍍、精細化學和放射性核素，農藥的使用和排放等。
[0003] 目前用于重金屬治理的方法主要有傳統的物理化學法和生物修復方法。傳統的物 理化學修復法對高濃度的重金屬污染比較有效，而對于環境中重金屬濃度污染修復效果不 好，而且物理化學方法所需設備較多，費用昂貴，且易造成二次污染。生物修復法是利用生 物的代謝機制吸收、沉淀、降解或者氧化還原一定濃度的有毒有害物。因此應加強具有高效 修復能力的微生物的研宄，在篩選大量抗重金屬微生物的基礎上，可將菌種馴化后進一步 與適當的工藝結合構建高效去除重金屬的工程菌，為微生物治理復雜環境的重金屬污染提 供更多選擇。
[0004] 生物修復是利用生物的生命代謝活動減少土壤環境中的有毒有害物的濃度或使 其完全無害化。從而使污染的土壤環境能夠部分地或完全地恢復到原來最初生態的過程。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題在于，通過抗重金屬菌株的富集及篩選，從活性污泥 中篩選出能夠降解重金屬Cr6+的馬胃葡萄球菌，將該菌株應用于重金屬污染修復，提高治 理重金屬污染的效率，減少二次污染，降低成本，為微生物治理復雜環境的重金屬污染提供 更多選擇。
[0006] 本發明還要解決的技術問題是提供上述菌株在降解重金屬離子中的應用。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：
[0008] 一株馬胃葡萄球菌，其分類命名為馬胃葡萄球菌馬胃亞種（Staphylococcus equorumssequorum)，菌株號NJ-5,已保藏于中國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC)，地 址為中國.武漢.武漢大學，郵編為430072,保藏編號為CCTCCNO:M2014486,保藏日期為 2014年10月15日。該菌株是發明人于2014年8月15號在江蘇省南京市的南京城北污水 處理廠的活性污泥中篩選得到的一株可以高效降解Cr6+等重金屬的菌株。
[0009] 篩選的過程，包括如下步驟：
[0010] a.選擇培養基的制備；
[0011] b.抗重金屬菌株的富集
[0012] c.抗重金屬菌株的篩選
[0013] d?菌體對重金屬降解能力的檢測。
[0014] 所述步驟a可以進一步包括：計算重鉻酸鉀中鉻離子的質量分數，溶于去離子水 中過濾除菌后配成l〇g/L濃度的貯備液。配置基礎培養基：LB培養基（g/L) -蛋白胨10g， 氯化鈉l〇g，酵母粉5g。LB培養基滅菌后，在使用時根據鉻濃度要求添加到培養基中。
[0015] 所述步驟b可以進一步包括：取lg活性污泥添加到9ml的液體LB培養基中富集 培養，培養條件37°C180r/min，培養24h;取lml富集培養液分別接種于含100mg/L金屬離 子的新鮮液體培養基，37°C、180r/min培養；待液體選擇培養基混濁后，從中取lml培養液 接種于含200mg/L金屬離子的液體培養基中，逐級類推提高金屬離子濃度。根據菌體對金 屬濃度耐受程度的不同，選取較高濃度的耐受生長條件進行多次富集培養。
[0016] 所述步驟c可以進一步包括：用接種環取最高耐受濃度培養液劃線接種于含相應 濃度金屬離子的固體平板上，37°C培養24h。根據平板菌落形態分別挑取單菌落再接種至液 體金屬選擇培養基進行驗證，循環三次，以獲得金屬耐受能力較好的純菌株。
[0017] 所述步驟d可以進一步包括：將篩選獲得的抗重金屬單菌落分別接種于相應的適 當濃度的液體金屬選擇培養基中，37°C、180r/min培養24h，10000r/min離心2min，取上清 用二苯碳酰分光度法方法測定Cr6+濃度。
[0018] 二苯碳酰分光度法方法測定Cr6+濃度，包括以下步驟：
[0019] ⑴標準曲線的繪制
[0020] 取 9 只 50ml比色管，依次加入 0, 0? 2,0? 5, 1. 00, 2. 00, 4. 00, 6. 00, 8. 00 和 10. 00ml 鉻標準標準液（1yg/ml)，加入1+1硫酸和1+1磷酸各0. 5ml，加入2ml顯色劑溶液，搖勻， 用水稀釋至標線。5-10min后，于540nm波長處，測定吸光度，并做空白校正。以吸光度為縱 坐標，相應六價鉻含量為橫坐標繪出標準曲線。
[0021] (2)菌液上清中六價鉻的測定
[0022] 取200yL過夜培養的菌液加到50ml比色管中，測定方法同標準溶液。用蒸餾水 進行空白校正后根據所測吸光度從校正曲線上查的六價鉻含量。
[0023] 菌株鑒定方法1 :
[0024] 16sRNA序列分析法：PCR擴增采用細菌16sRNA通用引物：
[0025] 27F(5,-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）
[0026] 1492R(5,-GGTTACCTTGTTACGACTT-3,）
[0027] PCR反應體系（25yL) : 5X擴增緩沖液（5yL)、
[0028] 基因組DNA(0. 1yL)、
[0029] dNTP(2yL)、
[0030] 引物F(0.5yL)、
[0031] 引物R(0.5yL)、
[0032] TaqDNA聚合酶（0? 25yL)
[0033] 去離子水（16. 65yL)
[0034] 反應條件：98°C預變性10min，98°C變形10s，58°C退火10s，72°C延伸90s，共30個 循環，72°C充分延伸10min。PCR產物，測序由南京金斯瑞有限公司完成。
[0035] 測得的基因序列如SEQIDNo:1所示。
[0036] 菌株的鑒定方法2 :
[0037] 挑取菌種純培養物單菌落，接種于BUG培養基平板，37°C恒溫培養24h，轉接1-2 代。在無菌條件下，使用Inoculatorz棉簽從BUG平板中沾取直徑約3mm的菌落接種于IF-A 接種液中，將濁度調整為90-98%。菌懸液倒入V型加樣水槽中，使用8道移液器將菌懸液 按順序加入微孔板的所有孔中，每孔100yL)。微孔板37°C恒溫培養16-24h，使用Biolog GenlllMicroStation自動微生物鑒定系統進行鑒定。
[0038]Biolog微生物鑒定系統利用微生物對不同碳源進行呼吸代謝的差異，在Biolog Genlll微孔板上對微生物進行94種表型測試（71種碳源利用、23種化學敏感性測試）。通 過檢測微生物代謝過程中產生的氧化還原物質與四唑類物質（如TTC、TV)發生反應而導致 的顏色變化（吸光度）以及由于微生物生長造成的濁度差異（濁度），生成特征指紋圖譜， 與標準菌株圖譜數據庫進行比對，即可得出鑒定結果，見圖3。
[0039] 上述馬胃葡萄球菌在降解