一種產漆酶的鮑曼不動桿菌及產漆酶的方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種產漆酶的鮑曼不動桿菌及產漆酶的方法和應用。
【背景技術】
[0002]鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)為非發酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界，屬于條件致病菌。鮑曼不動桿菌有莢膜、菌毛，無芽孢和鞭毛；具有較強的粘附力，易于附著于物體表面。鮑曼不動桿菌具有復雜的抗原構造，包括菌體抗原以及莢膜抗原，根據不同的抗原可以將鮑曼不動桿菌分為34個血清型。
[0003]漆酶(Iaccase)是一種含銅的多酚氧化酶，含有19種氨基酸，漆酶有一定的含糖量，真菌漆酶是一種糖蛋白，由肽鏈、糖配基和Cu2+三個部分組成，分子量在60-390kDa，肽鏈一般由500-550個氨基酸組成，糖配基有氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖和阿拉伯糖，占整個分子重量的10% -80%糖配基組成及含量的不同是漆酶分子量存在較大差異的主要原因。漆酶能夠催化酚類、芳胺類、羧酸類、留體類激素、生物色素、金屬有機化合物和非酚類物質生成醌類化合物、羰基化合物和水，屬于銅藍氧化酶(或稱為銅藍蛋白酶)中的一小族，廣泛存在于真菌、植物和昆蟲中，有報道細菌也能產生漆酶。目前還沒有關于鮑曼不動桿菌也能產漆酶的報道。
【發明內容】
[0004]為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種產漆酶的鮑曼不動桿菌，鮑曼不動桿菌能夠產生漆酶。
[0005]本發明的另一目的在于提供一種利用鮑曼不動桿菌產漆酶的方法，通過該方法獲得漆酶，用于染料脫色。
[0006]本發明還提供了漆酶在染料脫色中的應用。
[0007]為解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下:
[0008]一種產漆酶的鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii LMUDac)，其該鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii LMUDac)于 2014 年 5 月 7 日提交保藏，保藏號為:CCTCCNO:M2014189 ;保藏單位:中國典型培養物保藏中心；保藏地址:中國.武漢.武漢大學；郵編:430072o
[0009]所述鮑曼不動桿菌分離方法步驟如下:
[0010]I)取食品廠排污口土樣，添加到含有CuSO4質量濃度為0.05%的LB液體培養基中，在37°C培養箱進行富集培養40-50小時；
[0011]2)利用無菌水進行梯度稀釋，然后用固體LB液體培養基進行稀釋平板法分離單個菌落；
[0012]3)利用含有1%質量愈創木酚的乙醇溶液和1%質量的α -萘酚的乙醇溶液進行顯色反應，挑選呈現粉紅色或灰黑色菌落進行反復劃線篩選獲取純菌落，接種于斜面培養基并進行搖瓶發酵復篩，對篩選出的菌株進行形態、生理生化特征采用Vitek 2系統方法、16sRNA基因分析等進行鑒定，鑒定出鮑曼不動桿菌。
[0013]本發明所述的鮑曼不動桿菌應用于生產漆酶。
[0014]利用本發明所述的鮑曼不動桿菌生產漆酶的方法，包括如下步驟:
[0015]I)培養基處理:在三角瓶中和試管中分別裝入培養基，調節培養基的pH值為6-8，滅菌后備用；
[0016]2)配置硫酸銅溶液:配制4%的硫酸銅溶液，滅菌后備用；
[0017]3)接種:將鮑曼不動桿菌接種步驟I)的試管中，在32_45°C的培養箱中培養，然后按照5%的接種量將試管中的菌體接種到步驟I)的三角瓶中；三角瓶放置在搖床培養箱中培養；
[0018]4)發酵培養:然后在三角燒瓶中加入步驟2)配制的硫酸銅溶液，使培養基中的銅離子的濃度為0.02-0.08%，繼續發酵培養5-8h ；
[0019]5)收集4)發酵培養液，在5000-8000r/min離心5_15分鐘，得到的沉淀物用蒸餾水溶解，在冰浴條件下，利用超聲細胞破碎儀破碎20-40分鐘后，再用10000-15000r/min高速離心10-30分鐘，丟沉淀取上清液，即為漆酶液。
[0020]具體地，上述方案中，步驟I)和步驟2)中，滅菌溫度為120-125°C，滅菌時間為15-25min。
[0021]具體地，上述方案中，步驟3)中培養箱中培養時間為20-25小時。
[0022]具體地，上述方案中，步驟3)中，培養條件為溫度37-47°C，搖床轉速為150-250r/min，培養20-25小時。
[0023]一種漆酶，其是利用本發明所述的鮑曼不動桿菌通過上述方法獲得。
[0024]一種生物脫色液，包含本發明所獲得的漆酶液，還包含丁香醛連氮和硫酸銅；該生物脫色液中，所述丁香醛連氮濃度為0.2-0.8mol/L ;銅離子濃度< 0.04% (wt/v)，漆酶濃度為 45000-46000U/L。
[0025]漆酶具有脫色的效果，但是其穩定性容易受溫度和pH值的影響，在本發明的研宄中發現，在其脫色過程中添加丁香醛連氮不僅能提高其活性還能提高其穩定性；因此，當漆酶結合丁香醛連氮使用時，能夠有效提高其脫色效果。
[0026]在本發明的研宄過程中，發明人發現:銅離子的存在對細菌漆酶產漆酶活性具有明顯的影響，當銅離子的濃度在0.02-0.08%這個范圍時，能夠明顯提高漆酶酶活。并且，進一步發現，銅離子的濃度在0.04%以下，漆酶活性隨著銅離子的濃度增加而逐步增加，但是當銅離子濃度大于0.04%以后，漆酶活性卻隨著銅離子的濃度增加而逐步降低，可能原因是銅離子抑制菌體生長而是菌體濃度偏低而導致的漆酶活性降級。因此，為了提高漆酶活性，作為優選的方案，在生物脫色液中銅離子的濃度< 0.04%
[0027]利用本發明所述的生物脫色液對結晶紫脫色的方法，其步驟為:將需要脫色的結晶紫染料用蒸餾水溶解后加入到上述生物脫色液中，于40-50°C的恒溫水浴鍋中反應。
[0028]相比現有技術，本發明的有益效果在于:
[0029]1.本發明所述的鮑曼不動桿菌具有較高的活性，生長速度快，穩定性好、不易變異，其發酵培養后可以獲得漆酶；
[0030]2.本發明中利用鮑曼不動桿菌產漆酶的方法，操作簡單，成本低；得到的漆酶活性尚;
[0031]3.本發明中通過當漆酶結合丁香醛連氮作為脫色液，不僅具有高活性，還具有較尚的穩定性，進而能夠有效提尚漆酶的脫色效果。
[0032]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0033]圖1為銅離子濃度對漆酶活性影響結果，其中橫坐標為銅離子濃度(wt/v% ),縱坐標為酶活性(IU);
[0034]圖2為pH值對漆酶活性影響結果，其中橫坐標為pH值，縱坐標為酶活性(IU)；
[0035]圖3為搖床培養溫度對漆酶活性影結果，其中橫坐標為搖床培養溫度(°C )，縱坐標為酶活性(IU);
[0036]圖4為添加硫酸銅與不添加硫酸銅對漆酶活性對照圖，其中橫坐標為培養時間(min)，縱坐標為酶活性(IU)。
【具體實施方式】
[0037]實施例1
[0038]產漆酶的鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii LMUDac)，其該鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii LMUDac)于 2014 年 5 月 7 日提交保藏，保藏號為:CCTCC NO:M2014189 ;保藏單位:中國典型培養物保藏中心；保藏地址:中國.武漢.武漢大學；郵編:430072ο
[0039]所述鮑曼不動桿菌分離方法如下:從廣州益海嘉里有限公司的排污口取土樣lg，添加到含有CuSO4質量濃度為0.05%的LB液體培養基10ml中，在37°C培養箱進行富集培養48小時，利用無菌水進行梯度稀釋，然后用固體LB液體培養基進行稀釋平板法分離單個菌落，利用含有I %質量愈創木酚的乙醇溶液和1%質量的α -萘酚的乙醇溶液進行顯色反應，挑選呈現粉紅色或灰黑色菌落進行反復劃線篩選獲取純菌落，接種于斜面培養基并進行搖瓶發酵復篩，鑒定其是否產漆酶；對篩選出的菌株進行形態、生理生化特征采用Vitek2系統方法、16sRNA基因分析等進行鑒定，鑒定為出鮑曼不動桿菌。
[0040]實施例2
[0041]—種漆酶，通過以下方法獲得:
[0042]I)培養基處理:在三角瓶中和試管中分別裝入培養基，調節培養基的pH值為6，于120°C滅菌25min，滅菌后備用；
[0043]2)配置硫酸銅溶液:配制4%的硫酸銅溶液，于125°C滅菌15min，滅菌后備用；
[0044]3)接種:將鮑曼不動桿菌接種步驟I)的試管中，在32°C的培養箱中培養25小時，然后按照5%的接種量將試管中的菌體接種到步驟I)的三角瓶中；三角瓶放置在搖床培養箱中培養，培養條件為溫度37°C，搖床轉速為150r/min，培養25小時；
[0045]4)發酵培養:然后在三角燒瓶中加入步驟2)配