一種檸檬酸發酵種子罐培養工藝的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及檸檬酸發酵領域，涉及一種檸檬酸發酵種子罐培養工藝。
【背景技術】
[0002] 檸檬酸（Citric acid)又名枸櫞酸，學名2-羥基丙烷-1,2, 3-三羧酸，分子式 C6H8O7(無水物），為白色顆粒狀或白色結晶粉末，相對密度為1. 6550,無臭，具有令人愉快 的強烈的酸味，入口爽快，無后酸味，安全無毒，被廣泛用作食品和飲料的酸味劑，全球范圍 內檸檬酸的生產主要通過產檸檬酸的黑曲霉發酵玉米、瓜干、木薯等原料來生產檸檬酸，其 中以玉米作為原料的居多，而發酵過程一般分為種子罐培育過程和發酵罐發酵兩部分，其 中尤以前期的種子罐培養更為重要，但是以玉米為原料的檸檬酸發酵種子罐培養過程中， 存在部分孢子發芽較早，料液PH下降，最終抑制其他孢子正常萌發，種子罐中出現菌種極 不均勻的狀態，這樣會導致種子罐中菌種生長不理想，如果以這樣的菌種接入發酵罐，極易 導致發酵生長不穩定，從而導致產能下降嚴重。
[0003] 現有解決方法一般以優化菌種為主要技術手段，其調整周期長，其菌種的優化需 要多種條件配合，一般在短時間內難以達到很好的想效果。
【發明內容】
[0004] 本發明針對現有檸檬酸發酵種子罐培養遇到的諸多技術瓶頸，提供了一種檸檬酸 發酵種子罐培養工藝，其特點是在檸檬酸發酵種子罐培養中，不同培養階段控制不同的培 養溫度、罐壓、通風比、攪拌速率，達到理想的培養效果；本發明根據菌種不同生長階段的特 性以及生長需要，調控培養溫度、罐壓、通風比、攪拌速率，以達到最優的培養效果。采用本 發明的工藝后，不僅能提高檸檬酸發酵種子培養效果，提高發酵穩定性，而且能加快發酵生 產強度、提高發酵糖酸轉化率和設備利用率，進而提高了企業的經濟效益，提升了企業的競 爭力。
[0005] 本發明僅對種子罐培育階段進行了改進，所采用的具體技術方案如下：其具體步 驟為：
[0006] (1)將玉米液化液打入發酵罐中，添加氮源、飲用水調節N含量與總糖濃度，制備 朽1檬酸發酵種子罐培養基；
[0007] (2)制備黑曲霉孢子懸浮液，按照每毫升種子液中接入70-90萬個孢子的比例，通 過血球計數板計數，計算出所需孢子懸浮液的體積，通過火焰圈法將孢子懸浮液接入種子 罐中培養基進行培養，檸檬酸發酵種子罐培養過程按照培養時間分為4個階段：培養0-12h 階段；培養12_16h階段；培養16-24h階段；培養24h至培養結束；
[0008] 其中培養0-12h階段，控制培養溫度：28-35 °C ;罐壓：0.05-0. IOMPa;通風比V/ V · min :0· 05-0. 08 ;攪拌速率：50-60rpm ;
[0009] 培養12_16h階段，控制培養溫度：調節降溫系統，通過菌種生長產生的熱量 將罐溫升溫至35-39 °C ;罐壓：0. 08-0. IOMPa ;通風比V/V · min :0. 12-0. 14,攪拌速率： 80-100rpm ；
[0010] 培養16-24h階段，控制培養溫度：35-39 °C ;罐壓：0. 10-0. 12MPa ;通風比V/ V · min :0· 20-0. 22 ;攪拌速率：80-100rpm ;
[0011] 培養24h至培養結束階段，控制培養溫度：35-39°C ;罐壓：0. 10-0. 12MPa ;通風比 V/V · min :0· 26-0. 28 ;攪拌速率：80-100rrpm。
[0012] 其中，之所以控制培養〇_12h階段的上述參數，主要原因在于其屬于孢子萌發階 段，28-35?即能夠有效限制活力旺盛的孢子過快的萌發，又不影響活力較弱的孢子萌發， 從而有效地將此階段的培養基pH值保持在4. 5以上，當培養基pH值低于4. 5時，就會對孢 子萌發產生強烈的抑制作用故而控制上述溫度范圍；此外，孢子萌發階段需氧量比較低，所 以要求的罐壓、通風比、攪拌速率都比較低，以維持萌發階段的需要為主；
[0013] 而在12_16h階段屬于菌絲球形成階段，此時孢子發芽后逐漸成球，此生長過程產 生熱量使得罐溫逐漸升高，因此通過控制溫度維持在35-39?是菌絲球的最佳生長溫度范 圍，而由于菌絲球的生長菌體的需氧量也逐漸提高，故而較之上一階段提高了通風比和攪 拌速率以增加氧氣的供給量；
[0014] 培養16_24h階段屬于菌體的快速生長階段，菌體在此階段生長代謝旺盛，呼吸作 用加快，其最適生長溫度與上一階段相同均在35-39?范圍內，但是由于其營養物質消耗 快，菌體需氧量大，故而在上一階段的基礎上進一步提高了通風比以增加氧氣的供給量，但 是此時產酸量較低不能過度提高通風比，防止菌體生長與產酸不能同步增長；
[0015] 培養24h至培養結束階段屬于菌體成熟產酸階段，菌體在此階段生長與產酸代謝 旺盛，檸檬酸產量較上一階段大大提高，菌體的呼吸作用旺盛，營養物質消耗快，菌體需氧 量最大，故而還需要進一步的提高通風比，以保證產酸的需氧量；
[0016] 與現有技術相比，本發明的最主要特征就是對種子罐培養過程進行了細化，并對 細化后的工藝參數進行了重新的調整，較之現有技術有著更好的效果，經過上述細化后發 明人通過對菌體的生長的趨勢研宄以及相應產酸量的影響，將細化后的每個培養段工藝參 數進行了培養，更能夠適應菌體的需要，較之現有技術中種子罐培養條件一成不變的情況， 可以給菌體提供更好的生長條件，提高了菌體的轉化和存活率，且產酸效率大大提高。
[0017] 其中步驟（1)中玉米液化液的總糖濃度為18. 00-24. 00g/100mL ;之后經過添加 氮源、飲用水調節N含量與總糖濃度后所獲得的檸檬酸發酵種子罐培養基中總糖濃度為 8.00-12. 00g/100mL。
[0018] 上述技術方案中，由于無機氮源可以被菌體快速吸收利用，而且價格相對便宜，所 以本發明氮源采用硫酸銨或尿素或碳銨，N源的加入量為培養基總質量的0. 04-0. 08%，總 糖為8. 00-12. 00g/100mL，如果總糖過低，則培養基不能為菌種生長提供足夠的C源；如果 總糖過高，則抑制孢子萌發和菌體生長。
[0019] 步驟（2)中檸檬酸發酵種子罐總培養時間在25-32h。
[0020] 步驟（2)中培養基菌球濃度大于400000個/ml ;這是由于在現有培養條件下黑曲 霉孢子的萌發率在60%左右，而為了達到最佳的培養效果，必須保證菌球濃度在400000個 /ml以上，而為了保證這一菌球濃度，則在接入時必須控制接入量一般為每毫升種子液中接 入70-90萬個孢子。
[0021] 上述的方法主要針對的是以黑曲霉為生產菌株的工藝，其中優選采用黑曲霉 C〇-827等，其接入量一般為每_升種子液中接入70-90萬個孢子。
[0022] 經過上述改進工藝獲得的種子罐菌種可以直接應用與后步的發酵工藝中，例如將 過濾玉米液化清液和玉米液化液混合制備發酵培養基，打入發酵罐中消毒后，移入種子罐 培養合格的菌種開始檸檬酸發酵，種子液體積占總發酵液體積的12 %，控制發酵控制參數 在合理范圍內至發酵終了。但是上述步驟均可以采用現有技術完成，發明人在此不再贅述。
[0023] 綜上所述，本發明的發明人對種子罐培養過程進行了細化，并對細化后的工藝參 數，特別是培養溫度、罐壓、通風比、攪拌速率分段控制，有效地縮短了不同孢子之間萌發速 率的差距，保證在種子培養的每個階段有合適的PH值、溫度與溶氧，有效地縮小了菌種之 間的差異，增強了檸檬酸發酵種子罐培養的穩定性，從而保證檸檬酸發酵持續穩定高效進 行，提高糖酸轉化率與發酵效率率，從而降低發酵成本。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合實施例來進一步說明本發明，可以使本領域技術人員更全面的理解本發 明，但不以任何方式限制本發明，其中發酵罐發酵時過濾玉米液化清液與玉米液化液混合 比例等參數均采用現有常規檸檬酸發酵過程中的參數，其他未標明的發酵罐發酵階段的參 數也均參考現有技術。下述實施例中所采用的黑曲霉均為黑曲霉Co-827。
[0025] 實施例1
[0026] 一種檸檬酸發酵種子罐培養工藝，其具體步驟為：
[0027] (1)將總糖為20. 50g/100mL玉米液化液打入種子罐中，同時添加飲用水和占 培養基總質量〇. 04%的N源，升溫至121°C消毒30分鐘，降溫至29. 5°C后，檢測總糖為 8. 50g/100mL ;制備黑曲霉孢子懸浮液，按照每毫升種子液中接入79萬個孢子的比例，通過 血球計數板計數，計算出所需孢子懸浮液的體積，通過火焰圈法將孢子懸浮液接入種子罐 中培養基進行培養；
[0028] (2)檸檬酸發酵種子罐培養的0-12h階段，控制培養溫度：29. 5-33. 5°C ;罐壓： 0· 06-0. 08MPa ;通風比：0· 06-0. 07(V/V · min);攪拌速率：55-57rpm。
[0029] (3)檸檬酸發酵種子罐培養的12_16h階段，控制培養溫度：調節降溫系統，通過 菌種生長產生的熱量將罐溫升溫至35. 5°C ;罐壓：0. 08-0. 09MPa ;通風比：0. 12-0. 13(V/ V · min)，攬拌速率：80_90rpm ;
[0030] (4)檸檬酸發酵種子罐培養的16-24h階段，控制培養溫度：36. 0-38. 5°C ;罐壓： 0· 11-0. 12MPa ;通風比：0· 21-0. 22(V/V · min);攪拌速率：85-95rpm。
[0031] (5)檸檬酸發酵種子罐培養的24-29h階段，控制培養溫度：35. 0-39. (TC ;罐壓： 0· 10-0. 12MPa ;通風比：0· 27-0. 28(V/V · min);攪拌速率：90-100rpm。
[0032] (6)將過濾玉米液化清液與玉米液化液混合后打入發酵罐中，開啟攪拌使培養基 混合均勻，升溫至90°C消毒30分鐘，然后降溫至35. 8°C ;
[0033] (7)將培養好的種子液移入發酵罐中，開始發酵，種子液體積占總發酵液體積的 12%，發酵液中菌球濃度達到46000個/mL，通風發酵至發酵終了；
[0034] 在此條件下，發酵55h，產酸18. 93%，轉化率101. 12%，發酵指數為3. 44g/L · h。
[0035] 實施例2
[0036] 一種檸檬酸發酵種子罐培養工藝，其具體步驟為：
[0037] (1)將總糖為23. 50g/100mL玉米液化液打入種子罐中，同時添加飲用水和占 培養基總質量0. 07%的N源，升溫至121°C消毒30分鐘，降溫至28. 5°C后，檢測總糖為 11. 80g/100mL ;制備黑曲霉孢子懸浮液，按照每毫升種子液中接入83萬個孢子的比例，通 過血球計數板計數，計算出所需孢子懸浮液的體積，通過火焰圈法將孢子懸浮液接入種子 罐中培養基進行培養；
[0038] (2)檸檬酸發酵種子罐培養的0-12h階段，控制培養溫度：28. 5-34. 5°C ;罐壓： 0· 06-0. 095MPa ;通風比：0· 07-0. 08 (V/V · min);攪拌速率：53-55rpm ;
[0039] (3)檸檬酸發酵種子罐培養的12_16h階段，控制培養溫度：調節降溫系統，通過 菌種生長產生的熱量將罐溫升溫至35. 8°C ;罐壓：0. 08-0. 09MPa ;通風比：0. 13-0. 14(V/ V · min)，攪拌速率：82_92rpm ;
[0040] (4)檸檬酸發酵種子罐培養的16-24h階段，控制培養溫度：35. 8-38. 5°C ;罐壓： 0· 10-0. 12MPa ;通風比：0· 21-0. 22(V/V · min);攪拌速率：85-95rpm ;
[0041] (5)檸檬酸發酵種子罐培養的24-30h階段，控制培養溫度：36. 0-39. (TC ;罐壓： 0· 11-0. 12MPa ;通風比：0· 27-0. 28(V/V · min);攪拌速率：85-95rpm ;
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