一種醋酸普蘭林肽的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及藥物的制備方法,特別是一種降糖多肽類藥物醋酸普蘭林肽的制備方 法。
【背景技術】
[0002] 醋酸普蘭林肽(Cas No: 196078-30-5)是一種由美國Amylin公司研發的人胰淀素 類似物,主要用于治療使用胰島素仍無法達到理想的血糖控制效果的I型與II糖尿病,其 中胰淀素是指由胰腺β細胞產生的一種協助機體進行血糖調節的激素。普蘭林肽的分子 式為 C171H267N51O53S2,其對應的分子量為 3949. 4,氨基酸序列為:1^8-078^811-1111^1 &-1111·-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-phe-Gly-Pr〇-I Ie-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH 20 美國專利 US5424394 中公開了 采用依次偶聯氨基酸區段的方法合成醋酸普蘭林肽,另一份美國專利US2009055867中也 公開了先合成四個氨基酸區段,再將這些氨基酸區段依次偶合,從而合成醋酸普蘭林肽的 方法,以上方法均采用了條件溫和的Fmoc固相合成法,但所使用的構建二硫鍵的碘氧化法 不夠簡便實用,且未詳細提及醋酸普蘭林肽的純化過程;在現有中國專利CN101525382中 公開了醋酸普蘭林肽的純化方法,該法需要經過兩次高效液相純化和一次陰離子交換轉鹽 制得純度大于98%的精制品,其過程復雜,純化收率僅為40. 3%。
【發明內容】
[0003] 本發明希望提供一種制備過程簡單實用的醋酸普蘭林肽的制備方法,包括了醋酸 普蘭林肽的合成與純化。
[0004] 本發明首先公開了一種醋酸普蘭林肽的制備方法,包括以下步驟:
[0005] I) Fmoc-Tyr (tBu)-Rink Amide-MBHA Resin 氨基樹脂的制備
[0006] 以 Fmoc-Tyr (tBu)-OH 和替代度為 0· 1 ?0· 5mmol/g 的 Rink Amide-MBHA Resin 氨基樹脂為起始原料,通過Fmoc固相合成法制備得到Fmoc-Tyr (tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基樹脂;
[0007] 2)全肽樹脂的合成
[0008] 將由步驟1)得到的Fmoc-Tyr (tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基樹脂按照肽序 在偶聯劑作用下依次偶聯除Tyr外剩余的每個氨基酸的保護氨基酸,每次偶聯一個氨基酸 的保護氨基酸后形成新的氨基樹脂,將所述新的氨基樹脂在脫保護劑的作用下進行脫保 護,再偶聯下一個氨基酸的保護氨基酸,以此循環至全部氨基酸連接完畢,得到全肽樹脂, 其中所述保護氨基酸為連接有保護基團的氨基酸,所述脫保護為將所述保護基團從所述保 護氨基酸上脫除的過程;
[0009] 3)全肽樹脂的切割
[0010] 將由步驟2)得到的全肽樹脂通過裂解液進行裂解,制得普蘭林肽的中間肽;
[0011] 4)中間肽的環化
[0012] 通過空氣氧化法在步驟3)制得的中間肽的內部構建出二硫醚鍵,得到粗肽,此處 所述空氣氧化法為將中間肽溶入純水后形成混合液,將混合液經PH調節后暴露在空氣中 自然氧化的方法;
[0013] 5)初步純化
[0014] 通過反相高效液相色譜法對由步驟4)得到的粗肽進行初步純化,得到純化肽;
[0015] 6)精制
[0016] 通過流動相中含有體積百分濃度為0. 1%的醋酸溶液的反相高效液相色譜法對由 步驟5)得到的所述純化肽進行轉鹽與精制,即得到醋酸普蘭林肽,其中所述轉鹽是指純化 肽與醋酸溶液反應得到普蘭林肽的醋酸鹽。所述醋酸溶液為將冰醋酸溶解于純水中得到的 溶液。
[0017] 在上述步驟1)中Rink Amide-MBHA Resin氨基樹脂的進一步優選為替代度為 0.25mmol/g〇
[0018] 上述制備方法的優選為:所述步驟2)中的偶聯劑為HOBT、DIC與DMF的混合溶液, 其與步驟1)中所述的Rink Amide-MBHA Resin氨基樹脂的摩爾比為1:1?5:1,其中HOBT 與DIC的摩爾比為1:1。
[0019] 另一種優選為:所述步驟2)中所述的每個氨基酸的保護氨基酸與步驟1)中所述 的Rink Amide-MBHA Resin氨基樹脂的摩爾比為1:1?5:1。
[0020] 另一種優選為:所述步驟2)中所述的脫保護劑為體積百分濃度為10?40%的哌 啶的DMF溶液,其用量為:所述哌啶的DMF溶液的體積與所述Rink Amide-MBHA Resin氨基 樹脂的物質的量之比為30:1?10:1,其中哌啶的DMF溶液是指將哌啶溶解于DMF中形成的 溶液。
[0021] 上述優選中,哌啶在反應體系中的濃度對保持氨基酸的構型起到重要作用,因此 選擇適當的濃度是很重要的。
[0022] 另一種優選為:所述步驟3)中所述裂解液為體積比為85 :10 :5的TFA、EDT與H2O 相混合的混合溶液,其用量為:所述裂解液的體積與所述全肽樹脂的質量的比為15:1? 5:1〇
[0023] 另一種優選為:所述步驟4)中所述的空氣氧化法的過程為:將中間肽溶入純水后 形成混合液,使用氨水將混合液PH值調至中性附近,再將其暴露在空氣中于室溫下自然氧 化1?2天,其后使用醋酸將PH值調節至3?5。
[0024] 另一種優選為:所述步驟5)中所述反相高效液相色譜法中使用10 μπι的C8反相 色譜柱,由體積百分濃度為〇. 1 %的三氟乙酸溶液作為極性流動相中的A相,由乙腈作為極 性流動相中的B相,所述A相與B相混合作為洗脫劑。
[0025] 在上述反相高效液相色譜法中進一步的優選為:所述步驟5)中的反相高效液相 色譜法包括以下步驟:
[0026] (1)以三氟乙酸溶液平衡10 μ m的C8反相色譜柱,其后取所述粗肽進樣,并采用三 氟乙酸溶液對進樣后的粗肽進行沖洗;
[0027] (2)對完成步驟(1)的粗肽進行梯度洗脫,所述洗脫劑中乙腈的體積百分比從 30%不斷上升至35%,以215nm的波長檢測色譜,觀察色譜中主峰的出現情況,當主峰出現 時,開始收集產物;
[0028] (3)對主峰峰頂出現前、峰頂附近、峰頂出現后的產物分段收集,至無雜峰出現時 結束收集;
[0029] (4)對步驟(3)中收集到的峰頂出現前、峰頂出現后的產物進行濃縮并對濃縮后 產生的粗肽重復步驟(1)至步驟(3)的過程多次;
[0030] (5)對步驟(3)與步驟(4)中收集到的峰頂附近的產物進行合并與旋轉濃縮,即得 到所述純化肽。
[0031] 所述醋酸普蘭林肽制備方法的另一種優選為:步驟6)中所述反相高效液相色譜 法中使用10 μπι的C8反相色譜柱,由水作為極性流動相中的A相,由體積比為40:60的水 與乙腈相混合形成的混合液作為極性流動相中的B相,由體積百分濃度為0. 1 %的醋酸溶 液作為極性流動相中的C相,所述B相與C相混合作為洗脫劑。
[0032] 在精制中使用的以上反相高效液相色譜法的進一步的優選為:步驟6)中所述反 相高效液相色譜法包括以下步驟:
[0033] (1)以所述A相平衡10 μ m的C8反相色譜柱,其后取所述純化肽進樣,并采用所述 A相對進樣后的純化肽進行沖洗,沖洗后的純化肽再進入所述的C相;
[0034] (2)對完成步驟(1)的純化肽進行梯度洗脫,所述洗脫劑中B相的體積百分比從 90%不斷升至100%,以215nm的波長檢測色譜,觀察色譜中主峰的出現情況,當主峰出現 時,開始收集產物;
[0035] (3)對主峰峰頂出現前、峰頂附近、峰頂出現后的產物分段收集,至無雜峰出現時 結束收集;
[0036] (4)對步驟(3)中收集到的峰頂出現前、峰頂出現后的產物進行濃縮并對濃縮后 產生的純化肽重復步驟(1)至步驟(3)的過程多次;
[0037] (6)對步驟(3)與步驟(4)中收集到的峰頂附近的產物進行合并與旋轉濃縮,即得 到所述醋酸普蘭林肽。
[0038] 對完成上述步驟的醋酸普蘭林肽精制液可以冷凍暫存,也可通過濾膜過濾后分裝 于適當容器中凍干,將凍干粉用潔凈的容器密封包裝并通過檢測后,即制得成品。
[0039] 本發明具有以下有益效果:
[0040] 1)采用簡便實用的空氣氧化法來構建二硫鍵;
[0041] 2)粗品僅需經過一次反相高效液相色譜純化和一次精制即可制得精制液,過程簡 單,操作方便;
[0042] 3)精制品的純度大于99%,純化總收率尚達51. 2%,有效的提尚了廣品生廣效率 和質量。
【附圖說明】
[0043] 圖1為本發明中的一種制備醋酸普蘭林肽的方法的完整工藝流程的演示圖。
【具體實施方式】
[0044] 醋酸普蘭林肽的詳細制備過程為:
[0045] I) Fmoc-Tyr (tBu)-Rink Amide-MBHA Resin 氨基樹脂的制備
[0046] 以 Fmoc-Tyr (tBu)-OH 和替代度為 0· 1 ?0· 5mmol/g 的 Rink Amide-MBHA Resin 氨基樹脂為起始原料,通過Fmoc固相合成法制備得到Fmoc-Tyr (tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基樹脂;
[0047] 2)全肽樹脂的合成
[0048] 將由步驟1)得到的Fmoc-Tyr (tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基樹脂按照肽序 在偶聯劑作用下依次偶聯除Tyr外剩余的每個氨基酸的保護氨基酸,每次偶聯一個氨基酸 的保護氨基酸后形成新的氨基樹脂,將所述新的氨基樹脂在脫保護劑的作用下進行脫保 護,再偶聯下一個氨基酸的保護氨基酸,以此循環至全部氨基酸連接完畢,得到全肽樹脂, 其中所述保護氨基酸為連接有保護基團的氨基酸,所述脫保護為將所述保護基團從所述保 護氨基酸上脫除的過程;
[0049] 3)全肽樹脂的切割
[0050] 將由步驟2)得到的全肽樹脂通過裂解液進行裂解,制得普蘭林肽的中間肽;
[0051] 4)中間肽的環化
[0052] 通過空氣氧化法在步驟3)制得的中間肽的內部構建出二硫醚鍵,得到粗肽,此處 所述空氣氧化法為將中間肽溶入純水后形成混合液,將混合液經PH調節后暴露在空氣中 自然氧化的方法;
[0053] 5)初步