一種油菜抗菌肽BnPRP1及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程和生物技術領域。具體涉及一種油菜抗菌肽BnPRPl及其應 用。
【背景技術】
[0002] 病原菌可引起包括人類，牲畜，作物和其他生物的嚴重病害，造成嚴重的經 濟損失。植物病原真菌是植物的重要病原菌，可引起80%以上的植物病害（張福麗， 王占斌，王志英.幾丁質酶在植物抗真菌病害中的作用.林業科技.2006,31 (3): 24-27)，造成世界糧食作物減產約 20 % (Knight S.C·，Anthony V.M·，Brady A.M.，et al. Rationale and perspectives ο n the developmentof fungicides.Annu Rev Phytopathol，1997,35:349-372)。許多重要植物病害都是真菌造成的，如馬鈴薯晚疫病、 稻瘟病、小麥白粉病、玉米大小斑病菌、大豆灰斑病、油菜菌核病等，每年都造成非常巨大 的經濟損失。另一方面，真菌在侵染植物的過程中，釋放出來的代謝產物一一真菌毒素 (mycotoxin)，對農作物以及人類的健康也造成極大的危害，如黃曲霉毒素（aflatoxin) 等。
[0003] 核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum)屬于子囊菌亞門、盤菌綱、柔膜菌目、核盤 菌科、核盤菌屬。是一種危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌。核盤菌可以廣 泛地侵染很多單子葉和雙子葉植物。核盤菌引起的菌核病是一種類似于灰霉的腐生營養 型真菌，這種破壞性病源侵染超過400種植物，分布廣泛。目前對菌核病的防治主要依靠 化學農藥，然而化學防治不僅成本高、污染環境，而且防效也不理想；同時，食品的安全性 也受到嚴重影響。油菜是世界上重要的油料作物之一，菌核病造成油菜的根，莖和角果 的腐爛，導致了巨大的產量損失。盡管菌核病嚴重威脅了農業生產，植物對核盤菌的寄 主抗性的分子機制，我們依然知之甚少。暨今為止還沒有發現完全免疫或者高抗的油菜 栽培品種（Liu, S.，Wang, H.，Zha ng，J.，Fitt，B. D.，Xu, Z.，Evans, N.，Liu, Y.，Yang, W.， and Guo, X. 2005. In vitro mu tation and selection of doubled-hapIoid Brassica napus lines with improved resistance to S clerotinia sclerotiorum. Plant Cell Rep. 24:133-144)，因此，探宄植物對這種病源的抗性機制，發現新的抗性基因具有深遠意 義。
[0004] 灰霉菌（Botrytis cinerea)，又稱灰葡萄孢菌，是一種廣寄主性的、能夠引起200 多種已知植物（如水果、蔬菜及花丼）灰霉病的壞死營養型病原真菌。其在空氣中廣泛分 布，不僅能夠侵染田間作物，同樣會給植物的采后階段造成巨大損失。灰霉菌能夠在低溫條 件下（〇°C)生長，靠產生大量的灰色分生孢子進行傳播，與其它采后病原真菌相比，具有潛 伏侵染和低溫致病的優勢。同時，其還具有繁殖快、遺傳變異大和適合度高的特點。日常 生活中遇到的果蔬放一段時間會長毛，多數就可能是受到了灰霉菌的侵染。灰霉病最初只 是流行于歐洲和美洲，自20世紀80年代才開始在中國發生蔓延。由于溫室和大棚種植技 術的推廣普及，作物灰霉病害嚴重，已成為蔬菜、花丼和林業苗培育基地生產的主要限制因 素。截止2013年，世界上尚未發現有任何一種植物對灰霉菌產生抗性（陳琪，丁克堅，檀根 甲，張曉偉，灰霉病菌菌株抗藥性變異及其遺傳性研宄。2003華東植物病理學術研討會暨江 蘇省植物病理學會第十次會員代表大會論文集）。因此發現新的抗灰霉菌的基因具有深遠 的意義。
[0005] 立枯絲核菌（Pyricularia grisea Sacc)是擔子菌無性態的一個屬，致病性復 雜，形態變化大，寄主范圍廣，是一類在自然界中廣泛存在的真菌，它廣泛分布于全世界 的耕作和非耕作中，且很容易從染病植株及土壤中分離得到。絲核菌的寄主范圍非常廣 泛，有許多植物病害是由此屬真菌引起，可以危害水稻、馬鈴薯、煙草、小麥、花生、棉花、 油菜、芝麻、大豆、大白菜、小白菜、各種甘藍、花椰菜、菠菜、芹菜、甜瓜、瓠瓜、茄科、以及 各種柑橘和大量蔬菜。這類真菌主要引起植物的苗期癢倒病和立枯病，也引起禾谷類作 物的紋枯病，因而引起許多植物病理學家和真菌分類學家的研宄興趣（黃江華，楊媚，周 而勛，戚佩坤，絲核菌研宄進展，仲愷農業技術學院學報2002，15(1):61-67，；1^1」3八； HEITALA A M ;KARJALAINEN R Identification of a uninucleate Rhizoctonia sp.By pathogenicity, hyphal anastomosis and RAPD analysis 1996)〇
[0006] 目前常用的病害防治措施，主要依靠化學農藥，然而化學防治不僅成本高、污染環 境，而且防效也不理想；同時，食品的安全性也會受到嚴重影響。隨著社會的進步，人們越 來越深刻地認識到長期大量使用化學農藥對生態環境和人類健康的危害。生物防治可以有 效地克服這些弊端，因而生物農藥越來越受到人們的重視。
[0007] 抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs)是一類具有抗菌活性的天然小分子 蛋白，廣泛存在于生物界，是機體非特異性免疫的重要組成部分，在體內體外均具有抗菌 活性（Gordo n YJ, Romanowski EG, A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Drugs. Curr Eye Res.2005, 30(7):505 -515)。抗菌肽的廣泛的生物學活性，對細菌真菌、原生動物、病毒和腫瘤等有很強的抑制作 用，具有高效、環保、不使病原菌產生耐藥性等優點使它在生物防治和醫學上具有良好的應 用前景（Gordon YJ, Romanowski E G, A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Dr ugs. Curr Eye Res.2005, 30(7):505 -515)。近年來已經成為植物抗病基因工程、養殖飼料添加劑，食品防腐劑、新興醫藥等領域的 研宄熱點，在疾病防治領域中是抗生素的理想替代品（Boman HG，Peptide antibiotics and their role in innateimmunity. Annu Rev Immunol. 1995,13 :61-92) 〇 在農業生產過程 中，用抗菌肽進行植保工作可以避免農用抗生素通過食物鏈的傳遞對人體產生的威脅。
[0008] 按照氨基酸序列及二級結構，已發現的植物抗菌肽可以分為植物防御素 （plant defensins)、脂轉移蛋白（lipidtransfer proteins，LTPs)，硫素（thionins)，蛻皮 素（snakins)，橡膠蛋白類（hev ein-like)，打結素類（knottin-like peptides)，鳳仙 花素（IbAMP)，和新近發現的養菜素 （she pherdins)、環肽（cyclotides)等（Hancock REff, Chappie DS，Peptide Antibiotics. Antimicrob Agent Chemother, 1999,43 (6)： 1317-1323)。抗菌肽基本上都具有一些共性，如：小分子量（〈lOKDa)，陽離子表面、正電荷 以及兩親性，這些特性使得抗菌肽能夠和細胞膜綁定并能夠插入到細胞內部，大部分抗菌 肽是通過破壞細胞膜從而使目標細胞死亡而達到殺菌目的。而另一些抗菌肽卻能夠通過細 胞膜上的離子通道進入到細胞內部破壞細胞而不破壞細胞膜（Vogel PMHaHJ:Structure- function relationships of antimicrobial peptides. Biochem Cell Biol 1998,76:235-246.)。脯氨酸富集類抗菌肽（PRPs)的殺菌方式就是通過不破壞細胞膜， 而是利用離子通道的方式進行的（L.Otvos J:The short proline-rich antibacterial peptide family. Cellular and Molecular Life Sciences 2002,59:1138_1150.)〇 大 多數類型的植物源抗菌肽對動物和植物細胞都沒有毒性（Murad AEPelegrini PB. Neto SM. Novel Findings of Defensins and their Utilization in Construction of Transgenic Plants. Transgenic Plant Journ al 2001(1) :39-48)。與動物源抗菌肽相比， 植物源抗菌肽更易于在作物中表達和調控，不容易被細胞內的蛋白酶降解。與其他殺菌劑 相比，植物來源的抗菌肽對環境的影響更小，更友好，更具開發成為抗真菌生物制劑的潛力 (Hancock REff, Chappie DS，Peptide Antibi otics. Antimicrob Agent Chemother，1999， 43 (6) : 1317-1323)。如將Rs-AFPs等植物抗菌肽基因導入微生物中進行發