α-葡聚糖磷酸化酶5CC5單位點(diǎn)突變體E535V及其制備方法和應(yīng)用

本發(fā)明涉及葡聚糖磷酸化酶突變體，尤其涉及煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶的單位點(diǎn)突變體及其在生物轉(zhuǎn)化淀粉中的應(yīng)用，屬于葡聚糖磷酸化酶突變體及其應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪是人類飲食中的三種主要營(yíng)養(yǎng)素，平衡它們的比例對(duì)于預(yù)防慢性疾病至關(guān)重要，如肥胖、ii型糖尿病、心血管疾病、高血壓和癌癥。良好的飲食結(jié)構(gòu)應(yīng)包含緩慢代謝的淀粉，這對(duì)預(yù)防慢性疾病至關(guān)重要。

2、纖維素是植物細(xì)胞壁的支撐材料，也是地球上最豐富的碳水化合物。全球農(nóng)業(yè)每年產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素生物量約為2000億噸，纖維素約占40%，每年生產(chǎn)800億噸纖維素；相比之下，全球谷物年產(chǎn)量約為27億噸，它含有約75%的淀粉，每年收獲20億噸淀粉作為食物和飼料。因此，作為食物/飼料的年度纖維素資源與淀粉的比例約為40。直鏈淀粉是通過(guò)α-1,4-糖苷鍵連接的線性葡聚糖，而纖維素是通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接的線性葡聚糖。人類可以消化α-1，4-糖苷鍵連接的葡聚糖（淀粉），但不能消化β-1，4-糖苷鍵連接的葡聚糖（纖維素），這是人體內(nèi)缺乏纖維素水解酶的緣故。將β-1，4-糖苷鍵連接的葡聚糖酶促生物轉(zhuǎn)化為α-1，4-糖苷鍵連接的葡聚糖以利用非食品生物質(zhì)生產(chǎn)淀粉具有應(yīng)用前景。

3、高效利用農(nóng)業(yè)廢棄物資源特別是將纖維素廢棄資源高效轉(zhuǎn)化為人造糧食則是緩解糧食危機(jī)，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一。合成生物技術(shù)的快速發(fā)展使人們打破自然合成路徑，創(chuàng)建高效人工生物合成體系成為可能，也為實(shí)現(xiàn)基于木質(zhì)纖維素原料的人造淀粉高效生物合成提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保障。

4、在前期研究中，本發(fā)明人與中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所的張以恒研究員合作開(kāi)發(fā)了一種新的基于木質(zhì)纖維素的生物精煉技術(shù)，可以生產(chǎn)人造食品（即，淀粉和蛋白質(zhì)這兩種最重要的食物成分），以應(yīng)對(duì)迫在眉睫的糧食危機(jī)，該技術(shù)改進(jìn)了酶解糖化玉米秸稈的工藝，使用成本最低的商品化纖維素酶混合物，有效去除混合物中的β-葡萄糖苷酶（bg），使用纖維素-酶-酵母復(fù)合物減輕產(chǎn)物抑制并將其應(yīng)用于預(yù)處理玉米秸稈。研究表明，去除纖維素酶組分中的β-葡聚糖酶（bg）只需要內(nèi)切葡聚糖酶（egs）和纖維素生物水解酶（cbhs）就能將纖維素水解成纖維素二糖。在纖維素二糖磷酸化酶（cbp）的作用下轉(zhuǎn)化為葡萄糖1-磷酸和葡萄糖，葡萄糖可被釀酒酵母細(xì)胞用于生產(chǎn)微生物蛋白，葡萄糖1-磷酸可被馬鈴薯來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶（pgp）進(jìn)一步催化生產(chǎn)人工淀粉。

5、纖維素體外無(wú)輔酶生物轉(zhuǎn)化為淀粉包括三個(gè)步驟：首先，使用不含bg的纖維素酶混合物將纖維素部分水解為纖維二糖；其次，在磷酸鹽存在下，cbp將纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖1-磷酸和葡萄糖；第三，來(lái)自葡萄糖1-磷酸的一個(gè)葡萄糖單元被添加到直鏈淀粉的非還原端。磷酸鹽在cbp和pgp之間循環(huán)的反應(yīng)由pgp催化，這種整合的生物工藝在纖維素向淀粉的生物轉(zhuǎn)化中具有很高的能源效率，并且不會(huì)浪費(fèi)纖維素中的任何葡萄糖單位。然而，目前該系統(tǒng)中酶的使用成本仍較高。如何進(jìn)一步提高酶元件催化性能，降低酶的生產(chǎn)和使用成本，提高體系的轉(zhuǎn)化效率，將直接決定該技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化可行性。

6、酶元件是體外多酶分子機(jī)器生物制造的核心，也是新生物煉制工廠的關(guān)鍵和核心?，F(xiàn)有的纖維素制淀粉的關(guān)鍵酶元件不同程度的存在催化效率低、穩(wěn)定性和適配性差或異源表達(dá)難等問(wèn)題，有待改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供是煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的突變體；

2、本發(fā)明的目的之二是提供所述煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的突變體的編碼基因。

3、本發(fā)明的目的之三是提供含有所述突變體的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體或含有所述重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞；

4、本發(fā)明的目的之四是將所述的煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的突變體、其編碼基因、含有所述突變體的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體或含有所述重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞等應(yīng)用于淀粉的合成或生物轉(zhuǎn)化。

5、本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

6、本發(fā)明的一方面是提供了煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點(diǎn)突變體，該單位點(diǎn)突變體是將氨基酸序列為seq?id?no.1所示的煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5進(jìn)行e535v單位點(diǎn)突變所獲得的單位點(diǎn)突變體，其氨基酸序列為seqid?no.2所示。

7、本發(fā)明中所述單位點(diǎn)突變體“e535v”表示將氨基酸序列為seq?id?no.1所示的煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的第535位氨基酸由谷氨酸（e）突變成纈氨酸（v）；本發(fā)明其余的單位點(diǎn)突變的表述依此類推。

8、本發(fā)明的另一方面是提供了煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點(diǎn)突變體的編碼基因。

9、本發(fā)明的另一方面是含有所述煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點(diǎn)突變體的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體或含有所述重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞；其中，所述重組表達(dá)載體可以為重組原核表達(dá)載體或重組真核載體。

10、本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備任何一項(xiàng)所述煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點(diǎn)突變體的方法，包括：

11、（1）將所述煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點(diǎn)突變體的編碼基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件連接構(gòu)建得到重組表達(dá)載體；

12、（2）將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，純化，即得。

13、為了提高所述煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點(diǎn)突變體的表達(dá)或純化效率；優(yōu)選的，步驟（1）中將煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點(diǎn)突變體的編碼基因的前端加上一段dockerin序列（agtactaaactatacggcgacgttaatgacgacggcaaagtgaattcaaccgatgcagtggcattaaagcgatacgtcttacgttctggaatatccatcaataccgacaatgccgatctcaacgaagacggtcgggttaatagtaccgaccttggcatactcaagagatacattctgaaagaaatagatactctgccttacaagaat（seq?id?no.3））后再與表達(dá)調(diào)控元件連接構(gòu)建得到重組原核表達(dá)載體；含有cbm3（纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域）的蛋白能夠由于cbm3對(duì)纖維素表面的高親和力吸附而緊密結(jié)合在纖維素表面，所以與纖維素結(jié)合上的含cbm3結(jié)構(gòu)域蛋白或復(fù)合物可以通過(guò)高速離心從水溶液中分離出來(lái)；通過(guò)實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌bl21?(de3)?中表達(dá)了一種重組蛋白——mini-scaffoldin；合成蛋白mini-scaffoldin包含了一個(gè)cbm3結(jié)構(gòu)域和三個(gè)不同的結(jié)合模塊cipa、cbpa和scab。由于結(jié)合模塊和dockerin之間的高親和性相互作用，蛋白與mini-scaffoldin可以組裝成一個(gè)酶復(fù)合物，此復(fù)合物可以通過(guò)mini-scaffoldin的cbm3結(jié)構(gòu)域與再生無(wú)定形纖維素（rac）進(jìn)行較好的吸附，最后通過(guò)高速離心實(shí)現(xiàn)對(duì)粗酶液中的蛋白的選擇性回收。

14、優(yōu)選的，步驟（2）中在進(jìn)行純化時(shí)的方法優(yōu)選為：將誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)的酶粗液產(chǎn)物中加入微晶纖維素后離心，收集沉淀用0.5?mol?edta重懸后再離心，取上清，即得純化的蛋白；將誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)的酶粗液產(chǎn)物中加入微晶纖維素后得到吸附在微晶纖維素上的酶與mini-scaffoldin復(fù)合物，將微晶纖維素與酶以及mini-scaffoldin復(fù)合物離心后得到的沉淀用0.5mol?edta重懸后再離心可以使得mini-scaffoldin與突變體蛋白上的dockerin結(jié)構(gòu)解離，由于mini-scaffoldin與微晶纖維素吸附不受影響，所以離心后沉淀為微晶纖維素和mini-scaffoldin，上清中是αgp蛋白，實(shí)現(xiàn)了對(duì)于酶粗液中突變體蛋白選擇性的高效回收。

15、本發(fā)明的再一方面是將所述的煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點(diǎn)突變體、其編碼基因、含有所述單位點(diǎn)突變體的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體或含有所述重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞等應(yīng)用于淀粉的合成或生物轉(zhuǎn)化。

16、本發(fā)明的一種優(yōu)選的具體實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種將所述的煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點(diǎn)突變體應(yīng)用于合成淀粉中的應(yīng)用，包括：以纖維二糖為底物，以所述的煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的單位點(diǎn)突變體為轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行酶促生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)得到淀粉；更優(yōu)選的，所述的轉(zhuǎn)化酶中還含有纖維素二糖磷酸化酶。

17、本發(fā)明針對(duì)纖維素制淀粉的關(guān)鍵酶元件存在的催化效率低、穩(wěn)定性和適配性差、異源表達(dá)難等問(wèn)題，通過(guò)宏基因組和公共數(shù)據(jù)庫(kù)的大數(shù)據(jù)分析及生物信息學(xué)方法，精準(zhǔn)挖掘新型纖維素降解和淀粉合成關(guān)鍵酶元件，挖掘鑒定得到來(lái)自煙草的新型α-葡聚糖磷酸化酶蛋白（αgp-5cc5）較土豆來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶蛋白（pgp）具有更好的酶活及淀粉合成功能；在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)挖掘鑒定的煙草來(lái)源的αgp-?5cc5的cap結(jié)構(gòu)域進(jìn)行單位點(diǎn)突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將氨基酸序列為seqid?no.1所示的煙草來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5進(jìn)行e535v單位點(diǎn)突變所獲得的單位點(diǎn)突變體，其酶活以及表達(dá)量均顯著高于野生型α-葡聚糖磷酸化酶。

18、本發(fā)明所涉及到的術(shù)語(yǔ)定義

19、除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。

20、術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)也意指寡核苷酸類似物，其包括pna（肽核酸）、在反義技術(shù)中所用的dna類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡(jiǎn)并密碼子取代）和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過(guò)產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以上所選（或所有）密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子取代（ mol?cell.?probes8:91-98?(1994)）。

21、術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。即，針對(duì)多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述術(shù)語(yǔ)適用于天然產(chǎn)生氨基酸聚合物以及其中一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術(shù)語(yǔ)涵蓋任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，其包括全長(zhǎng)蛋白（即抗原），其中氨基酸殘基經(jīng)由共價(jià)肽鍵連接。

22、術(shù)語(yǔ)“突變”和“突變體”在此具有它們的常用含義，指的是在核酸或多肽序列中的遺傳的、天然存在的或引入的變化，它們的意義與本領(lǐng)域人員通常所知的意義相同。

23、術(shù)語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞株”或“宿主細(xì)胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì)或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。

24、術(shù)語(yǔ)“可操作的連接”指兩個(gè)或更多個(gè)元件之間功能性的連接，可操作的連接的元件可為鄰接或非鄰接的。

25、術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指將編碼基因?qū)氲剿拗骷?xì)胞內(nèi)部這樣的方式將多核苷酸或多肽遺傳轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。

26、術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”：內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。