一種醫(yī)用導(dǎo)管抗細(xì)菌粘附性能測(cè)試方法、接種液孵育裝置及裝置的應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于植介入類醫(yī)療器械，具體涉及一種醫(yī)用導(dǎo)管抗細(xì)菌粘附性能測(cè)試方法、接種液孵育裝置及該裝置在醫(yī)用導(dǎo)管抗細(xì)菌粘附性能測(cè)試中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、細(xì)菌粘附主要表現(xiàn)在醫(yī)學(xué)、食品安全和工業(yè)方面，在大多數(shù)情況下，細(xì)菌粘附帶來(lái)的是負(fù)面影響，尤其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。醫(yī)療器械感染是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，細(xì)菌粘附是細(xì)菌感染的關(guān)鍵步驟，其引起的手術(shù)感染是醫(yī)院最常見(jiàn)的感染之一。隨著醫(yī)學(xué)生物材料應(yīng)用增多，感染發(fā)病率也明顯增高，如何防治生物材料相關(guān)感染是臨床急需解決的問(wèn)題。

2、細(xì)菌粘附是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，受多種因素影響如細(xì)菌自身特性、所處環(huán)境、材料表面特性等。目前材料的細(xì)菌粘附性能測(cè)試沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，最傳統(tǒng)且常用的檢測(cè)方法是菌落形成單位計(jì)數(shù)法(cfu法)，但此種方法存在諸多問(wèn)題，如無(wú)法對(duì)不規(guī)則材料進(jìn)行整體評(píng)估。因此多年來(lái)發(fā)展出了一系列替代cfu的檢測(cè)方法，其中運(yùn)用較廣泛的是三磷酸腺苷法(atp法)。atp法是通過(guò)活細(xì)胞中的atp與熒光素發(fā)生氧化反應(yīng)發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與微生物數(shù)量成正比從而間接測(cè)定粘附細(xì)菌的數(shù)量。該方法雖然快速、靈敏、易于操作，但染料需進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而且非微生物的atp也會(huì)對(duì)檢測(cè)造成干擾，因此準(zhǔn)確性有待提高。

3、中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)cn109666403a公開(kāi)了一種功能涂料技術(shù)領(lǐng)域的抗粘附涂層組合物及抗粘附涂層，其中抗粘附涂層組合物包括聚硅氮烷底料和抗粘附材料，聚硅氮烷底料和抗粘附材料通過(guò)預(yù)反應(yīng)或后反應(yīng)進(jìn)行交聯(lián)。該發(fā)明所制備的涂層基材為石英玻片，采用菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行材料的抗粘附性測(cè)試。雖然涂層材料的附著力較強(qiáng)，抗粘附性良好，但是這里采用的抗粘附性測(cè)試方法具體步驟不明確，不易重復(fù)，且針對(duì)的是片狀材料，不適用于醫(yī)用導(dǎo)管類。

4、中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)cn116375963a公開(kāi)了一種水性聚氨酯防粘附涂層的制備方法和應(yīng)用，該發(fā)明提供的氟化水性聚氨酯材料及其涂層具有良好的生物相容性和防粘附性，可應(yīng)用于長(zhǎng)期置留的介入類醫(yī)療器械，但是申請(qǐng)中是將片狀涂層材料置于24孔板中與菌液進(jìn)行共同孵育，然后經(jīng)沖洗、超聲取得粘附菌，通過(guò)鋪板實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)粘附菌的數(shù)量并以此判斷涂層的抗粘附性能，該方法無(wú)法直接應(yīng)用于管狀材料表面抗細(xì)菌粘附性的測(cè)試。

5、中國(guó)發(fā)明專利cn111662950a公開(kāi)了一種重組發(fā)光銅綠假單胞菌pao1-lux在醫(yī)用材料細(xì)菌粘附性檢測(cè)中的應(yīng)用。首先將luxcda?be基因整合至標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌菌株pao1的染色體中，通過(guò)pia選擇培養(yǎng)基篩選獲得的重組發(fā)光菌株pao1-lux，用m9培養(yǎng)基，ph6.2，37±1℃進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)光值檢測(cè)窗口期6-24h，可應(yīng)用于金屬鋁、金屬鋅、玻璃、pe手套、醫(yī)用紗布等醫(yī)用材料粘附細(xì)菌的檢測(cè)。該方法較傳統(tǒng)方法具有靈敏、簡(jiǎn)便、可實(shí)時(shí)觀測(cè)、可觀測(cè)具體粘附位置等特點(diǎn)，但是重組發(fā)光菌株的制備涉及分子生物學(xué)，不易實(shí)現(xiàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求較高。

6、涉及到醫(yī)用導(dǎo)管類材料的抗細(xì)菌粘附性測(cè)試沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，目前帶涂層的醫(yī)用導(dǎo)管主要是通過(guò)將抑制細(xì)菌粘附的涂層直接涂覆在基材上，如硅片、石英玻片、聚氨酯片等，然后裁切樣品至適當(dāng)大小，放入24孔板中，加入接種液，孵育一段時(shí)間后，對(duì)樣品進(jìn)行沖洗，洗去表面的浮游細(xì)菌后再進(jìn)行超聲震蕩處理或棉簽擦取，洗脫粘附菌，再通過(guò)活菌計(jì)數(shù)判斷樣品對(duì)細(xì)菌的抗粘附效果。另外，對(duì)簡(jiǎn)單沖洗后的樣品進(jìn)行掃描電子顯微鏡（sem）觀察，也可判斷待測(cè)樣品對(duì)細(xì)菌的粘附情況。但是前者多直接應(yīng)用于片狀材料，后者用到sem，需要制備樣品、鍍金等，操作較為復(fù)雜且對(duì)設(shè)備要求較高，不具有普適性。

7、醫(yī)用導(dǎo)管類相對(duì)于其他形狀的材料在與細(xì)菌接種液共同孵育時(shí)不易固定，如果采用浸泡的處理方式，材料底部無(wú)法充分接觸接種液，而且管腔內(nèi)部會(huì)粘附一些細(xì)菌無(wú)法徹底清理，這些因素都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。開(kāi)發(fā)一種可用于醫(yī)用導(dǎo)管表面抗細(xì)菌粘附性的測(cè)試方法，測(cè)試過(guò)程中可以將管狀材料合理固定在細(xì)菌濃度均勻的接種液中，保證導(dǎo)管充分與接種液接觸的測(cè)試方法尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本發(fā)明的目的在于提供了一種醫(yī)用導(dǎo)管抗細(xì)菌粘附性能測(cè)試方法，該方法采用含懸浮態(tài)細(xì)菌的均一化接種液孵育裝置對(duì)待測(cè)醫(yī)用導(dǎo)管進(jìn)行細(xì)菌的接種孵育，可以使導(dǎo)管類材料各表面均與接種液均勻接觸，提高測(cè)試準(zhǔn)確性。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供一種接種液孵育裝置，包括盛放接種液的箱體1、安裝于所述箱體1底部的攪拌部7和支撐架4，所述支撐架4頂部安裝支撐軸3；所述箱體1表面覆蓋箱蓋8。所述箱體1側(cè)面底部可設(shè)置排水孔5方便接種液的排出，排水孔5的數(shù)量可根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)置。支撐架4在箱體1的兩側(cè)呈兩兩對(duì)稱分布，用于支撐固定有待測(cè)導(dǎo)管的支撐軸3，其數(shù)量依據(jù)待測(cè)導(dǎo)管的數(shù)量隨機(jī)調(diào)節(jié)。

4、進(jìn)一步地，所述攪拌部7包括磁力攪拌驅(qū)動(dòng)裝置，所述磁力攪拌驅(qū)動(dòng)裝置的上表面嵌入所述箱體1中并與箱體1底面齊平，待測(cè)導(dǎo)管孵育時(shí)，將攪拌轉(zhuǎn)子6放在攪拌驅(qū)動(dòng)裝置的內(nèi)表面，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)子6帶動(dòng)箱體1中菌懸液的流動(dòng)使細(xì)菌保持懸浮均一狀態(tài)。

5、進(jìn)一步地，所述支撐軸3包括圓柱體，所述圓柱體的長(zhǎng)度大于待測(cè)導(dǎo)管的長(zhǎng)度。所述圓柱體的直徑略小于待測(cè)導(dǎo)管的內(nèi)徑，在待測(cè)導(dǎo)管穿入時(shí)，利用待測(cè)導(dǎo)管自身的彈性，實(shí)現(xiàn)兩者的緊密結(jié)合。其數(shù)量可依據(jù)待測(cè)導(dǎo)管的數(shù)量隨機(jī)調(diào)節(jié)。

6、進(jìn)一步地，所述箱蓋8靠近接種液的一側(cè)安裝有滅菌器，所述滅菌器包括紫外燈。箱蓋8的另外一側(cè)可設(shè)置把手10。

7、本發(fā)明還提供了一種接種液孵育裝置在醫(yī)用導(dǎo)管抗細(xì)菌粘附性能測(cè)試中的應(yīng)用，測(cè)試時(shí)，將所述支撐軸3穿入待測(cè)導(dǎo)管后，浸沒(méi)于所述箱體1中完成細(xì)菌的接種孵育；所述箱體1中含有細(xì)菌保持懸浮均一狀態(tài)的接種液。

8、本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種醫(yī)用導(dǎo)管抗細(xì)菌粘附性能測(cè)試方法，主要包括接種液制備、待測(cè)導(dǎo)管孵育和抗粘附性能測(cè)試步驟，所述待測(cè)導(dǎo)管孵育步驟主要通過(guò)將待測(cè)導(dǎo)管置于接種液孵育裝置中完成細(xì)菌的接種孵育。

9、進(jìn)一步地，所述待測(cè)導(dǎo)管孵育步驟主要包括：（a）將接種液孵育裝置和待測(cè)導(dǎo)管進(jìn)行滅菌處理；（b）將支撐軸3穿入待測(cè)導(dǎo)管中后放到支撐架4上；（c）將接種液加入箱體1中并完全淹沒(méi)待測(cè)導(dǎo)管，蓋上箱蓋8，用封口膜密封，將孵育裝置放入生化培養(yǎng)箱中，于37±1℃下控制攪拌部持續(xù)勻速攪拌孵育6-24h。

10、進(jìn)一步地，所述接種液制備過(guò)程包括：將ⅲ代菌落接種到1/10氯化鈉蛋白胨緩沖液中，采用比濁法確定菌液濃度為（6±0.2）×108cfu/?ml，10倍稀釋法稀釋菌液至6×104~6×107cfu/ml即得。所述待測(cè)導(dǎo)管的材質(zhì)包括乳膠、硅膠、聚氨酯、聚乙烯、聚氯乙烯等。

11、進(jìn)一步地，所述接種液制備過(guò)程包括：將ⅲ代菌落接種到10ml的1/10氯化鈉蛋白胨緩沖液中，采用比濁法確定菌液濃度約為6×108cfu/ml，10倍稀釋法稀釋菌液至適當(dāng)濃度即得。其中，ⅲ代菌的培養(yǎng)過(guò)程為：取-80℃凍存的大腸桿菌（atcc?8099）、金黃色葡萄球菌（atcc?6538p）在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行復(fù)蘇傳代及培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取少許凍結(jié)的菌種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上，于37±1℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行ⅰ代傳代培養(yǎng)，24±2h后將ⅰ代菌通過(guò)劃線的方式接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行ⅱ代傳代培養(yǎng)，重復(fù)培養(yǎng)方法直到獲得活性較高的ⅲ代菌落用于實(shí)驗(yàn)。所有的培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)用耗材在使用前均需進(jìn)行滅菌處理。

12、進(jìn)一步地，所述抗粘附性能測(cè)試步驟主要包括：（d）使用生理鹽水清洗孵育后的待測(cè)導(dǎo)管3-8次，除去表面浮游細(xì)菌；其中清洗方式可以是浸洗或沖洗或兩者疊加使用，以保證浮游細(xì)菌去除徹底；（e）將清洗后的導(dǎo)管置于生理鹽水中超聲震蕩10±1min或渦旋震蕩2±0.5min以除去待測(cè)導(dǎo)管表面的粘附菌得到菌懸液；（f）將菌懸液進(jìn)行稀釋，后取1ml加入到一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將滅菌后降至適當(dāng)溫度的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入到培養(yǎng)皿中并進(jìn)行搖晃，使細(xì)菌均勻分散；（g）待培養(yǎng)基凝固后放入生化培養(yǎng)箱中于37±1℃培養(yǎng)24±2h，對(duì)生長(zhǎng)出來(lái)的細(xì)菌菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)照組菌落數(shù)的平均值記作?對(duì)照，樣品組菌落數(shù)的平均值記作?樣品，抗細(xì)菌粘附效率記作gr，計(jì)算公式gr=(?對(duì)照-?樣品)/?對(duì)照×100%

13、進(jìn)一步地，所述接種液中細(xì)菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和銅綠假單胞菌中的任意一種；細(xì)菌外的成分包括1/10氯化鈉蛋白胨緩沖液或1/500營(yíng)養(yǎng)肉湯。

14、本發(fā)明的有益效果是：

15、1.本發(fā)明中的測(cè)試方法，模擬醫(yī)用導(dǎo)管在醫(yī)療過(guò)程中的真實(shí)使用狀態(tài)對(duì)其表面的抗細(xì)菌粘附性能進(jìn)行測(cè)試，可代替測(cè)試片材間接表征導(dǎo)管類材料的抗細(xì)菌粘附性能的方法，能直接實(shí)現(xiàn)對(duì)導(dǎo)管類材料管體的抗細(xì)菌粘附性能測(cè)試，使導(dǎo)管類材料抗細(xì)菌粘附性測(cè)試結(jié)果更直觀、更準(zhǔn)確。

16、2.本發(fā)明中的測(cè)試方法，在待測(cè)導(dǎo)管孵育步驟主要通過(guò)將待測(cè)導(dǎo)管置于含懸浮態(tài)細(xì)菌的均一化接種液孵育裝置中完成細(xì)菌的接種孵育。克服了現(xiàn)有測(cè)試方法中接種液上層細(xì)菌含量低，下層細(xì)菌含量高的問(wèn)題。

17、3.本發(fā)明中的測(cè)試方法，孵育裝置中的支撐軸用于固定不同直徑的待測(cè)導(dǎo)管，待測(cè)導(dǎo)管與支撐軸緊密結(jié)合后浸沒(méi)在菌懸液中，克服了現(xiàn)有測(cè)試方法中材料底部無(wú)法充分接觸接種液，而且管腔內(nèi)部會(huì)粘附一些細(xì)菌無(wú)法清理徹底的問(wèn)題。

18、4.本發(fā)明中的測(cè)試方法，孵育裝置中的支撐架和支撐軸數(shù)量可根據(jù)測(cè)試樣品量進(jìn)行調(diào)整，可以實(shí)現(xiàn)同一批次實(shí)驗(yàn)樣品間的一致性，保證測(cè)試條件的一致性，降低實(shí)驗(yàn)誤差。常規(guī)的操作方法中，樣品是一個(gè)一個(gè)處理的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致性差。

19、5.本發(fā)明中的測(cè)試方法，能單獨(dú)測(cè)管體外壁的抗粘附性。常規(guī)的12孔板靜置測(cè)試時(shí)，內(nèi)壁往往粘附很多菌，不易被清洗，超聲后會(huì)把內(nèi)壁的菌超出來(lái)，菌落計(jì)數(shù)時(shí)影響外壁的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

20、6.本發(fā)明中的測(cè)試方法，抗粘附性能測(cè)試時(shí)采用浸洗或沖洗或兩者疊加使用的方式對(duì)孵育后待測(cè)導(dǎo)管清洗3-8次，以除去表面浮菌的同時(shí)不破壞粘附菌的粘附。

21、7.本發(fā)明中的測(cè)試方法，抗粘附性能測(cè)試時(shí)采用超聲震蕩10±1min或渦旋震蕩2±0.5min實(shí)現(xiàn)粘附菌的去除，同時(shí)保證了粘附菌的活性。