第一基因片段和第二基因片段的用途、引物組和探針、試劑盒及其構建方法與流程

本發明涉及生物，尤其涉及第一基因片段和第二基因片段的用途、引物組和探針、試劑盒及其構建方法。

背景技術：

1、貓細小病毒（feline?parvovirus，fpv）又稱貓泛白細胞減少癥病毒，俗稱貓瘟病毒，該病毒可引起貓的發熱、嘔吐、出血性腸炎和白細胞減少等癥狀，致死率較高。犬細小病毒（canine?parvo?virus，cpv）可導致腸胃炎和心肌炎，發病速度快、死亡率高，隨著病毒抗原漂移，該病毒還可以感染貓、小熊、貂等動物。貓細小病毒（feline?parvovirus，fpv）和犬細小病毒（canine?parvovirus，cpv）是親緣關系密切的兩種細小病毒，都屬于細小病毒科，原細小病毒屬，肉食動物原細小病毒1型種的成員，為單股dna病毒。近年來，貓感染犬小病毒病時有發生，由于貓細小病毒在貓上感染的臨床癥狀與犬細小病毒感染相似，在出現急性病毒性出血性腸炎的貓的診斷上多半會忽略排除犬細小病毒感染的可能性，因此造成治愈率較低的情況。貓細小病毒和犬細小病毒混合感染動物時，從臨床癥狀上難以做出鑒別診斷，必須借助實驗室檢測手段確診。

2、通過細胞培養技術分離貓細小和犬細小病毒是診斷的金標準方法，雖然具有高度特異性，但費時、費力且昂貴，而且需要熟練的專業人員，因此應用范圍窄。目前已開發出多種免疫學方法用于直接鑒定，包括酶聯免疫吸附試驗（elisa）、乳膠凝集試驗（lat）、血凝試驗（ha）、熒光抗體試驗（fat）等。這些實驗室方法大多用于檢測特異性抗原或抗體，有資料顯示fpv與cpv同源性達98%以上。cpv和fpv可產生交叉免疫性和血清學交叉反應，所以免疫學的方法均存在靈敏度低和特異性不好的問題，無法鑒別貓細小病毒和犬細小病毒。pcr技術可用于擴增無法培養的病原體，由于pcr檢測是設計與病原序列完全匹配的特異性引物序列，因此具有高度特異性，可在短時間內檢測目標基因。

3、進化分析數據顯示，cpv與fpv序列同源性高，vp2基因僅存在0.5?%的差異性，有報道認為它們可能來源于同一個祖先適應不同的宿主進化而來。cpv可以感染貓，但是fpv至今為止未有感染犬的報道；并且多例研究報道了cpv和fpv混合感染貓的情況。針對貓細小和犬細小病毒的鑒別診斷方法，現有的技術如下：

4、可應用dna?測序和利用單克隆抗體的血凝抑制試驗進行fpv和cpv的鑒別，前者需要提取病毒dna進行pcr擴增，并且一般需要送公司測序，比較耗時耗力，后者需要多種單克隆抗體，不適用于普遍使用。

5、decaro等以單核苷酸多態性位點g3752a為基礎設計一對引物和探針，建立了能夠鑒別檢測fpv和cpv?dna的taqman?mgb?real?time?pcr方法（decaro?et?al.,?2008）。但序列的保守性非常影響試驗結果，最近中國報道hb3毒株?（genbank?no.kt162043）3752堿基位點發生突變，導致單核酸突變無法鑒別。

6、中國農業科學院的孫亞茹在其學位論文《不同抗原型犬細小病毒及其與貓細小病毒分子鑒別方法的建立及初步應用》中通過genbank上下載所有fpv和cpv基因組全序列，利用mega7進行序列比對分析，發現了一個穩定snp?a4408c位點，并且該位點附近為保守片段。設計一對引物f1/r1擴增包含該突變位點的361bp大小的保守片段，構建標準質粒；設計一對引物f2/r2，建立了鑒別fpv和cpv的qpcr-hrm方法，但該方法需要使用昂貴的pcr儀及分析軟件，且qpcr-hrm反應擴增程序大約需要2?h，耗時較長，不適合寵物醫院使用，并且通過分析序列發現，該方法中的特異性引物無法鑒別fpv和cpv；

7、擴增阻滯突變系統（amplification?refractorymutation?system，arms）技術是newton等首先建立用來檢測已知突變的方法。在此基礎上發展起來的鑒別檢測方法arms-qpcr的基本原理利用引物的3’端堿基與模板堿基不互補，用dna聚合酶無法延伸，而與模板堿基互補引物，用dna聚合酶正常延伸。再結合熒光探針檢測可以進行對snp位點的實時熒光鑒別檢測。目前此法已用于多種疾病的點突變的檢測，也開始應用于病原的鑒別檢測。引物設計時的堿基類型對pcr的擴增具有極大的影響，引物的3’端引入不同堿基類型的錯配，擴增效率不一致，引物3’端g變為c，t變為g以及c變為a的擴增效率最低，極大地阻礙了擴增，在進行引物設計時可利用這點為引物設計的特異性提供參考。有其研究表明，引物與模板之間的堿基結合為c-c，g-a，a-g，a-a時，結合率最低，擴增反應阻礙最明顯。

8、taqman探針是一種雙標記、自淬滅的水解探針，其5’和3’末端分別標記熒光基團和淬滅基團，在探針結構完整時兩者距離較近，熒光基團的信號可被淬滅。而在pcr擴增過程中，若taqman探針與靶標序列完全匹配，探針則可結合在dna模板上，此時taq酶延伸至探針位置時，其外切酶活性將切割水解探針，釋放熒光基團，使得熒光信號增強。而且，隨著擴增產物的增多，熒光信號越來越強，從而可通過儀器實時監測熒光信號的變化過程。針對雙等位基因snp，可分別設計兩種對應的探針，只有探針與模板完全匹配時，在擴增過程中探針可被水解產生較強的熒光信號，而如果探針與靶序列之間存在錯配，其熒光強度將會減弱，由此可通過熒光強度檢測snp位點。探針檢測能夠容忍的核苷酸錯配個數為6個，且探針中間的位置比探針兩端更為敏感，tm值下降更快，探針發生核苷酸錯配時，其對擴增效率影響不大，影響的主要是tm值的變化，當錯配增加到一定個數時，擴增曲線將直接表現為陰性。

9、現有技術1：中國專利申請cn202111628075.0公開了一種貓和/或犬病原體的pcr檢測試劑盒及檢測方法和應用，該方案的試劑盒包括用于檢測犬瘟熱病毒、檢測犬甲型流感病毒、犬副流感病毒、犬細小病毒、犬冠狀病毒、犬輪狀病毒、犬巴貝斯蟲、犬蛔蟲、犬埃立克體、犬布魯氏菌、狂犬病病毒、伯氏疏螺旋體、內參基因actb、貓皰疹病毒、貓杯狀病毒、貓細小病毒、貓冠狀病毒、貓免疫缺陷病毒、貓白血病病毒、貓血支原體、貓支原體、貓衣原體、賈第鞭毛蟲、弓形蟲、巴爾通體和內參基因gapdh的引物及探針，將采集貓犬dna和rna加入該試劑盒，采用實時熒光pcr儀進行pcr反應，每一循環采集fam、hex、rox和cy5熒光信號，進行相關病原體的分析，較傳統檢測方法特異性更強、靈敏度更高；

10、進一步觀察該方案的說明書可見，雖然本方案能夠同時檢測多種病毒，但測試過程中所使用的引物和探針均存在區別，即每種病毒均采用了其具有高特異性的片段進行引物的設計進行擴增。

11、現有技術2：中國專利申請cn202310047212.4公開了一種貓犬病原體快速檢測的方法、引物組合物及試劑盒，以解決現有寵物病原體檢測方法存在的檢測準確度低，且成本高，或者是檢測過程復雜、時間長，且器械設備費用十分高昂等技術問題。

12、該方法包括：

13、1、采集待檢測的病原體樣本；

14、2、樣本經核酸純化或裂解液直接裂解處理；

15、3、擴增反應；3?.1、針對每一個待檢測的病原體確定特異性的引物組并設計擴增體系；

16、3、將步驟2處理后的樣本以及對應的引物組加入擴增體系進行擴增反應；

17、4、可視化檢測；觀察擴增反應后反應液的顏色是否變化，若有顏色變化，則感染相應的病原體，若沒有顏色變化，則未感染相應的病原體。

18、進一步觀察該方案可見，該方案盡管能夠同時檢測包括貓細小病毒、犬細小病毒在內的多種病毒，但該方案同時針對不同病毒的特異性片段設計了不同的擴增體系，并將多個擴增體系融合，實現同時對多種病毒的檢測；

19、綜上可見，現有技術中，盡管具有能同時檢測多種病毒的試劑盒，但上述試劑盒均是根據多個病毒的特異性片段設計其對應的擴增引物，并且由于多個病毒的特異性片段的差別較大，因此在檢測過程中，多組引物、探針之間難免產生拮抗作用進而導致檢測結果產生偏差。

20、本技術需要解決的問題：如何通過fpv和cpv中相似度較高的片段進行引物、探針的設計，并且在檢測過程中能夠區分fpv和cpv。

技術實現思路

1、本技術的目的是提供一種用于快速鑒別貓細小病毒和犬細小病毒的引物組和探針，由于引物組和探針在設計過程中參考的第一基因片段和第二基因片段的高度相似性，本技術中的引物和探針之間產生的拮抗作用較小，并且仍能夠實現貓細小病毒和犬細小病毒的有效篩分。

2、為實現上述目的，本技術公開了通過貓細小病毒的第一基因片段和犬細小病毒的第二基因片段制備用于快速鑒別貓細小病毒和犬細小病毒的引物組和探針的用途；

3、所述第一基因片段的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

4、所述第二基因片段的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

5、此外，本技術還公開了一種用于快速鑒別貓細小病毒和犬細小病毒的引物組和探針，所述引物組包括第一引物組、第二引物組；

6、所述第一引物組通過對貓細小病毒的第一基因片段設計得到；

7、所述第二引物組通過對犬細小病毒的第二基因片段設計得到；

8、所述第一引物組包括第一上游引物、第一下游引物；

9、所述第二引物組包括第二上游引物、第二下游引物；

10、所述第一上游引物與第二上游引物或第一下游引物與第二下游引物中的至少一組核苷酸序列不完全相同；

11、所述探針包括與第一基因片段中的特異性片段對應的第一探針、與第二基因片段中的特異性片段對應的第二探針。

12、優選地，所述第一上游引物與第二上游引物的核苷酸序列不完全相同，所述第一下游引物與第二下游引物的核苷酸序列相同。

13、優選地，所述第一上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

14、所述第二上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

15、所述第一下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；

16、所述第一探針的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

17、所述第二探針的核苷酸序列如seq?id?no.7所示。

18、此外，本技術還公開了一種用于快速鑒別貓細小病毒和犬細小病毒的試劑盒，含有如上所述的用于快速鑒別貓細小病毒和犬細小病毒的引物組和探針；

19、所述引物組和探針以反應液的形式添加至試劑盒內，所述反應液還包括5×mdx140?mix、滅菌水。

20、優選地，所述反應液具體包括4μl的5×mdx140?mix，1μl的第一上游引物，1μl的第二上游引物，2μl的第一下游引物，0.5μl的第一探針，0.5μl的第二探針，10μl的滅菌水。

21、優選地，所述試劑盒由反應液、陽性對照品、陰性對照品組成，所述陽性對照品為含有第一基因片段的第一質粒、含有第二基因片段的第二質粒的混合質粒的稀釋液，所述稀釋液由第一質粒、第二質粒制得的混合質粒稀釋至106copies/μl制得，且第一質粒與第二質粒的質量比為1：1；

22、所述陰性對照品為ddh2o。

23、優選地，所述試劑盒具體包括19μl/管的反應液共10管，50μl/管的陽性對照品共1管，50μl/管的陰性對照品共1管。

24、此外，本技術還公開了一種用于構建上述的用于快速鑒別貓細小病毒和犬細小病毒的試劑盒的構建方法，包括以下步驟：

25、步驟1：篩選得到第一基因片段、第二基因片段；

26、步驟2：根據第一基因片段、第二基因片段中核苷酸序列相同的部分設計得到第一上游引物、第二上游引物、第一下游引物；

27、步驟3：根據第一基因片段中的特異性片段設計得到第一探針，根據第二基因片段中的特異性片段設計得到第二探針；

28、步驟4：將第一上游引物、第二上游引物、第一下游引物、第一探針、第二探針制成反應液并與陽性對照品、陰性對照品混合，得到用于快速鑒別貓細小病毒和犬細小病毒的試劑盒。

29、本技術的有益效果是：一方面本技術的引物組和探針可對貓細小病毒和犬細小病毒進行快速鑒別診斷，利用qpcr直擴檢測方法，極大縮短了檢測所需的時間，直接加樣本，只需通過一步熒光觀測，無需測序，可快速進行鑒別貓細小和犬細小病毒的診斷；

30、另一方面，本技術的qpcr方法利用貓細小病毒和犬細小病毒差異大的靶點作為特異性靶標，采用擴增阻滯突變系統（amplification?refractory?mutation?system,arms）技術與taqman雙等位基因snp結合的方法對貓細小病毒和犬細小病毒的檢測，具有較高的特異性；

31、并且由于引物組和探針在設計過程中參考的第一基因片段和第二基因片段的高度相似性，本技術中的引物和探針之間產生的拮抗作用較小，且仍能夠實現貓細小病毒和犬細小病毒的有效篩分。