一種增強secD和ftsY基因轉錄水平的谷氨酰胺轉氨酶高產菌株及其制備方法

本發明涉及生物工程，具體涉及一種增強secd和ftsy基因轉錄水平的谷氨酰胺轉氨酶高產菌株及其制備方法。

背景技術：

1、公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

2、谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，ec?2.3.2.13）能夠使蛋白質發生交聯作用，可以改善肉制品的外觀、口感、風味和營養特性；可以提升酸奶品質，提高植物蛋白的彈性和持水能力；此外，谷氨酰胺轉氨酶還可以用于制備薄膜，替代高分子合成材料制造的食品包裝薄膜。因此，谷氨酰胺轉氨酶在食品加工、包裝等領域具有極其廣泛的應用前景。

3、根據來源不同谷氨酰胺轉氨酶可以分為兩類，來源于動植物組織的稱為組織谷氨酰胺轉氨酶（tissuetransglutaminase，ttgase），來源于微生物發酵制備的稱為微生物谷氨酰胺轉氨酶（microbialtransglutaminase，mtgase）。隨著市場需求的增長，谷氨酰胺轉氨酶的規模化生產制備受到了廣泛的關注。由鏈霉菌屬（ s.mobaraensis）發酵生產谷氨酰胺轉氨酶是合成谷氨酰胺轉氨酶的主流方法，但仍存在著較大的發展潛力和提升空間。目前，關于谷氨酰胺轉氨酶研究處于蓬勃發展階段，且多集中在菌株發酵條件、產物提取純化等方面，而高效菌株的選育一直是行業內的研究熱點。

技術實現思路

1、為了克服上述問題，本發明提供了一種增強secd和ftsy基因轉錄水平的谷氨酰胺轉氨酶高產菌株及其制備方法。

2、為實現上述技術目的，本發明采用如下技術方案：

3、本發明的第一個方面，提供一種谷氨酰胺轉氨酶高產菌株，在茂原鏈霉菌中過表達secd（sec-dependent?translocase?subunit?d）基因和/或ftsy（filamentoustemperature-sensitive?y）基因。

4、在一種或多種實施方式中，一種谷氨酰胺轉氨酶高產菌株，是在茂原鏈霉菌中過表達secd基因，所述secd基因的序列如seq?id?no.1所示。

5、上述谷氨酰胺轉氨酶高產菌株中，過表達secd基因的方法是將secd基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表達質粒中的啟動子之后進行表達；

6、所述在茂原鏈霉菌中過表達secd基因的方法包括：

7、將含有secd的編碼基因的片段導入所述茂原鏈霉菌中；

8、所述secd的編碼基因的片段是通過重組表達載體導入的；

9、所述重組表達載體具體是將所述片段插入pib139的多克隆位點間得到的；

10、所述重組表達載體具體構建方法包括：將含有secd的編碼基因的片段插入pib139的nde?i和xba?i酶切位點間，得到質粒i；

11、在一種或多種實施方式中，一種谷氨酰胺轉氨酶高產菌株，在茂原鏈霉菌中過表達ftsy基因，所述ftsy基因的序列如seq?id?no.2所示。

12、上述谷氨酰胺轉氨酶高產菌株中，過表達ftsy基因的方法是將ftsy基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表達質粒中的啟動子之后進行表達。

13、所述在茂原鏈霉菌中過表達ftsy基因的方法包括：

14、將含有ftsy的編碼基因的片段導入所述茂原鏈霉菌中；

15、所述ftsy的編碼基因的片段是通過重組表達載體導入的；

16、所述重組表達載體具體是將所述片段插入pib139的多克隆位點間得到的；

17、所述重組表達載體具體構建方法包括：將含有ftsy的編碼基因的片段插入pib139的nde?i和xba?i酶切位點間，得到質粒ii。

18、上述任一所述的茂原鏈霉菌為茂原鏈霉菌 streptomyces?mobaraensisgl。

19、本發明的第二個方面，提供一種谷氨酰胺轉氨酶高產菌株的構建方法，包括：

20、將含有secd的編碼基因和/或ftsy的編碼基因的片段導入所述茂原鏈霉菌中，獲得過表達secd基因和/或ftsy基因的谷氨酰胺轉氨酶高產菌株；

21、所述secd基因的序列如seq?id?no.1所示；

22、所述ftsy基因的序列如seq?id?no.2所示。

23、在一種或多種實施方式中，一種谷氨酰胺轉氨酶高產菌株的構建方法，包括：將含有secd的編碼基因的片段導入所述茂原鏈霉菌中，獲得過表達secd基因的谷氨酰胺轉氨酶高產菌株。

24、所述secd的編碼基因的片段是通過重組表達載體導入的；

25、所述重組表達載體具體是將所述片段插入pib139的多克隆位點間得到的；

26、所述重組表達載體具體構建方法包括：將含有secd的編碼基因的片段插入pib139的nde?i和xba?i酶切位點間，得到質粒i。

27、在一種或多種實施方式中，一種谷氨酰胺轉氨酶高產菌株的構建方法，包括：將含有ftsy的編碼基因的片段導入所述茂原鏈霉菌中，獲得過表達ftsy基因的谷氨酰胺轉氨酶高產菌株。

28、所述ftsy的編碼基因的片段是通過重組表達載體導入的；

29、所述重組表達載體具體是將所述片段插入pib139的多克隆位點間得到的；

30、所述重組表達載體具體構建方法包括：將含有ftsy的編碼基因的片段插入pib139的nde?i和xba?i酶切位點間，得到質粒ii。

31、在一種或多種實施方式中，上述任一所述的茂原鏈霉菌為茂原鏈霉菌 streptomyces?mobaraensisgl。

32、本發明的第三個方面，提供上述谷氨酰胺轉氨酶高產菌株在制備谷氨酰胺轉氨酶中的應用。

33、本發明的第四個方面，提供一種制備谷氨酰胺轉氨酶的方法，包括：

34、將上述谷氨酰胺轉氨酶高產菌株活化，獲得谷氨酰胺轉氨酶高產菌株孢子，將谷氨酰胺轉氨酶高產菌株孢子接種于種子培養基中，培養得到種子液，將種子液接入發酵培養基中，發酵培育獲得谷氨酰胺轉氨酶。

35、在一種或多種實施方式中，活化谷氨酰胺轉氨酶高產菌株的培養基為高氏一號培養基，高氏一號培養基中包括：可溶性淀粉20g/l，kno31?g/l，nacl?0.5?g/l，k2hpo4?3h2o0.5?g/l，mgso4?7h2o?0.5?g/l，feso4?7h2o?0.01?g/l，瓊脂20?g/l。

36、在一種或多種實施方式中，谷氨酰胺轉氨酶高產菌株于高氏一號固體培養基上活化的溫度為28~32?℃，優選為30?℃，時間為5~7天。

37、在一種或多種實施方式中，種子培養基包括：甘油20?g/l，蛋白胨20?g/l，酵母粉5g/l，mgso4·7h2o?2?g/l，k2hpo42?g/l，kh2po42?g/l；種子培養基的ph為7.0。

38、在一種或多種實施方式中，將谷氨酰胺轉氨酶高產菌株孢子接種于種子培養基中，培養得到種子液的條件包括：培養溫度為28~32?℃，優選為30?℃；搖床頻率為180~220rpm，優選為200?rpm；培養時間為20~30?h，優選為24?h。

39、優選的，種子液接入發酵培養基中的接種量為8%~15%（體積比），優選為10%（體積比）。

40、在一種或多種實施方式中，發酵培養基包括：甘油20?g/l，蛋白胨20?g/l，酵母粉5g/l，玉米漿干粉20?g/l，kh2po44?g/l，k2hpo42?g/l，mgso4·7h2o?2?g/l，nh4cl?3.2?g/l；發酵培養基的ph為7.0。

41、在一種或多種實施方式中，發酵培育時的培育條件包括：培養溫度為28~32?℃，優選為30?℃；搖床頻率為180~220?rpm，優選為200?rpm。

42、本發明的有益效果在于：

43、在茂原鏈霉菌發酵過程中，谷氨酰胺轉氨酶在胞內以前體蛋白加信號肽即pre-pro-tgase形式存在，通過跨膜運輸，識別并切割信號肽，以酶原（pro-tgase）的形式分泌到細胞外，再由胞外的金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶激活，形成有活力的谷氨酰胺轉氨酶。研究表明，分泌蛋白利用sec（secretion）通路和信號識別顆粒（signal?recognitionparticle，srp）等途徑透過細胞質膜，因此過表達蛋白質轉運相關的secd基因或ftsy基因，有可能提高谷氨酰胺轉氨酶的轉運速率，進而加快谷氨酰胺轉氨酶的分泌。基于此，本發明在茂原鏈霉菌 streptomyces?mobaraensisgl中過表達與蛋白質轉運相關的secd基因或ftsy基因，構建突變菌株，實驗結果表明，相比于原始茂原鏈霉菌 streptomyces? mobaraensisgl，將含有secd的編碼基因的片段導入所述茂原鏈霉菌 streptomyces? mobaraensisgl中形成的突變株gl-p1以及將含有ftsy的編碼基因的片段導入所述茂原鏈霉菌 streptomyces?mobaraensisgl中形成的突變株gl-p2均可以大幅提高谷氨酰胺轉氨酶的產量。在實驗室搖瓶水平下突變株的產量對比野生型菌株分別提高37.47%、64.5%。