一種突變型R-轉氨酶及其制備烏布吉泮中間體的方法與流程

本發明涉及生物酶催化領域，具體地說涉及一種突變型r-轉氨酶及其制備烏布吉泮中間體的方法。

背景技術：

1、烏布吉泮（ubrogepant）是一種cgrp小分子受體拮抗劑，已被fda在2019年批準用于急性偏頭痛治療。降鈣素基因相關肽（cgrp）是偏頭痛發作的重要介質，烏布吉泮對人類cgrp受體表現出極高的親和力，通過阻止cgrp與其受體結合，并對抗cgrp的神經血管效應，進而達到終止偏頭痛發作。

2、(5s,6r)-3-(叔丁氧基羰基)氨基-6-甲基-5-苯基-l-哌啶-2-酮（化合物ii）是制備烏布吉泮中的一個重要內酰胺片段，可通過4-苯基-2-(叔丁氧基羰基)氨基-5-氧代己酸異丙酯（化合物i）經轉氨反應合成。化合物i含有兩個手性中心，其對應的d1、d2、s1、s2四個異構體，利用特異性r-轉氨酶在第5號位引入第三個r構型手性中心，使該酶只作用于化合物i中d1和d2構型，而對s1和s2無用，酶催化對應的產物為dw1和dw2，其酯鍵可自發斷裂環合成為(5s,6r)構型的化合物ii。反應體系剩余的s1和s2構型化合物由于差相異構作用，隨著d1和d2減少，自發向d1和d2構型轉變，進而制備高手性純度化合物ii。但如果前述的r-轉氨酶可以轉化為s1和s2構型，則會導致(5r,6r)構型的化合物iii產生，進而影響化合物ii的手性純度。

3、

4、美國專利申請us20150038707a1（公開日2015年02月05日）披露了選用節桿菌屬轉氨酶以化合物i為底物制備化合物ii的方法，底物濃度50g/l，加入50%?二甲基亞砜（dmso），反應18-24小時，轉化率大于99%，產物dr值大于60:1。該酶的轉化能力有限，且底物濃度超過50g/l后需要加入dmso助溶。而dmso的加入引入了新的有機溶劑，為后續處理帶來困難，往往難以清除干凈。

技術實現思路

1、發明目的：本發明的目的是提供一種適用于高底物濃度且有機溶劑耐受性高的突變型r-轉氨酶，其能將4-苯基-2-(叔丁氧基羰基)氨基-5-氧代己酸異丙酯高效轉化為高dr值的(5s,6r)-3-(叔丁氧基羰基)氨基-6-甲基-5-苯基-l-哌啶-2-酮；本發明還有一個目的是提供編碼前述突變型r-轉氨酶的基因序列；本發明還有一個目的是提供包含前述基因序列的重組載體；本發明還有一個目的是提供包含前述重組載體的宿主細胞；本發明還有一個目的是提供利用固定化r-轉氨酶在全有機相中以高濃度底物轉化高dr值的烏布吉泮中間體(5s,6r)-3-(叔丁氧基羰基)氨基-6-甲基-5-苯基-l-哌啶-2-酮的制備方法。

2、此處需要說明的是，本發明所述的dr值為“非對映體比率”，具體來說，是指產物中(5s,6r)構型化合物ii與(5r,6r)構型化合物iii的比值。該比值越大，化合物ii（目標產物）的手性純度越高。

3、本發明提供的突變型r-轉氨酶，其具有如seq?id?no:?1或seq?id?no:?2所示的氨基酸序列。該酶來自野生型土霉菌（aspergillus?terreus）的轉氨酶，其野生型具有如seqid?no:?9所示的氨基酸序列，通過在第60位、第115位、第117位、第240位、第276位的任一一個或多個位點突變獲得。

4、作為本發明的優選方案，所述r-轉氨酶如seq?id?no:?2所示，其突變位點為y60f,f115t，e117p和r240a，該酶可達到65%以上的轉化率和大于100:1的dr值。作為本發明的最優方案，所述r-轉氨酶如seq?id?no:?1所示，其突變位點為y60f,?f115t，e117p，a276g和r240a，該酶可達到85%以上的轉化率和大于100:1的dr值。野生型轉氨酶中第60位的y（酪氨酸），第115位的f（苯丙氨酸），第117位的e（谷氨酸）和第276位的a（丙氨酸）是構成底物與酶活性位點結合催化口袋的重要氨基酸殘基，該口袋結構影響第180位的活性位點k（賴氨酸）進攻化合物i，化合物i與第180位k距離越近越容易產生r構型，從而影響催化活性及化合物ii構型。

5、進一步地，本發明提供的基因序列用于編碼所述突變型r-轉氨酶，其具有如seqid?no:?5或seq?id?no:?6所示的核苷酸序列，其分別編碼如seq?id?no:?1和seq?id?no:?2所示的氨基酸序列。

6、本發明通過構建重組載體，加入到感受帶宿主細胞以獲得表達所述r-轉氨酶的工程菌株。所述重組載體包含前文所述的基因序列，其選用的表達載體包括但不限于pet、pgex、pmal的任意一種，優選pet-28質粒。所述宿主細胞選用包括但不限于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、畢赤酵母的任意一種，其中以大腸桿菌作為宿主細胞為優選實施方式。

7、本發明提供了一種(5s,6r)-3-(叔丁氧基羰基)氨基-6-甲基-5-苯基-l-哌啶-2-酮的制備方法，包括如下步驟：

8、（1）將權利要求3所述的宿主細胞接種培養，破碎分離上清液，獲得r-轉氨酶粗酶液；

9、（2）將所述r-轉氨酶粗酶液與大孔樹脂載體混合，制備獲得固定化r-轉氨酶；

10、（3）在不含dmso的有機相反應體系中，以4-苯基-2-(叔丁氧基羰基)氨基-5-氧代己酸異丙酯為底物，將所述底物充分溶解后加入氨基供體，然后加入所述固定化r-轉氨酶，獲得(5s,6r)-3-(叔丁氧基羰基)氨基-6-甲基-5-苯基-l-哌啶-2-酮。

11、本發明提供的方法采用有機溶劑耐受性高的突變型r-轉氨酶，因而可利用高濃度有機相溶解底物而不需要加入dmso，避免了后續分離dmso的工藝。優選地，所述有機相選自飽和或不飽和的乙酸乙酯、甲苯、乙醇、乙腈、甲基叔丁基醚或乙酸異丙酯中的任意一種或多種的組合。特別是利用飽和的有機相溶劑進行溶解。更優選地，所述飽和的有機溶劑選自c1-c6的酯類或醚類溶劑，例如飽和甲基叔丁基醚或飽和乙酸異丙酯。與乙醇、乙腈等傳統溶劑相比，甲基叔丁基醚和乙酸異丙酯的極性較小，蛋白結構不容易被破壞。

12、進一步地，由于溶劑體系的改良，因此可以投加更高濃度的底物以提高收率。所述反應體系中底物的初始濃度為80-150g/l，更進一步地，底物濃度可選自100-150g/l，甚至120-150g/l。

13、進一步地，所述固定化r-轉氨酶與底物的質量比為0.5-3:1。

14、進一步地，所述反應體系在40-65℃，更優選地在50-60℃溫度下反應。

15、進一步地，所述氨基供體選自異丙胺、1,4-丁二胺、l-谷氨酸或l-丙氨酸中的任意一種或多種的組合。其中優選采用異丙胺作為氨基供體。

16、進一步地，所述氨基供體中的氨基與所述底物的摩爾比為2-5:1，過量氨基供體有利于底物轉化率提高。

17、進一步地，所述固定化r-轉氨酶中還包括磷酸吡哆醛（plp），是向所述r-轉氨酶粗酶液中加入plp混合后，再與所述大孔樹脂載體混合，振蕩過夜，抽濾、洗滌后冷藏備用。所述磷酸吡哆醛與固定化酶的質量比為1:200-500。

18、

19、進一步地，本發明選用的大孔樹脂載體選自lx-1000ha、lx-1000ep、lx-1000nh、sepabeadsec-hfa、sepabeadsec-ha、sepabeadsec-hfa/s、sepabeadsexe119、sepabeadsexe120、diaionhp2mg中的任意一種或多種的組合。其中優選diaionhp2mg樹脂作為載體，其為甲基丙烯酸單體交聯制得的大孔吸附樹脂，能夠有效吸附和分離極性物質，并具有較高的重復使用率。特別是該樹脂在較低極性反應體系中，可以最大地防止酶蛋白從柱上脫落，影響到酶的催化活性。因此特別適用于工業化連續生產。

20、作為本發明的進一步優化，可將本發明所述的固定化酶填充至固定化床進行工業化生產反復使用。將所述的固定化r-轉氨酶安裝好后，按照上述方法配制料液（包含底物和有機相）并倒入柱中，利用蠕動泵調節流量進行循環催化。批次反應結束后，排掉料液，加入新配置的料液進行下一批次的生產。利用本發明所述的固定化酶和循環反應體系，固定化酶可重復生產且能達到15次轉化率不低于90%的生產效果。

21、通過上述方法制備獲得的(5s,6r)-3-(叔丁氧基羰基)氨基-6-甲基-5-苯基-l-哌啶-2-酮（化合物ii），具有不低于99%的轉化率和大于100:1的dr值。