雙向聚合-轉錄擴增編碼的雙色熒光生物傳感器用于無標記和無引物檢測多種piRNA

本發明涉及雙向聚合-轉錄擴增編碼的雙色熒光生物傳感器用于無標記和無引物檢測多種pirna，屬于生物分析。

背景技術：

1、小非編碼rna是一類長度為21-31個核苷酸的非編碼rna(ncrna)，可分為piwi相互作用rna(pirnas)、小核rna(snrna)、微小rna(mirnas)、核糖體rna(rrnas)和小核仁rna(snornas)等幾個亞類。其中，在果蠅生殖細胞中發現的pirna是一類較少被探索的小非編碼rna，長度大多為24-31個核苷酸。與mirna和sirna相比，pirna的產生不依賴于dicer核糖核酸酶，其3'端被2'-o-甲基化修飾，具有抗氧化降解的能力。此外，pirna可以特異性結合argonaute蛋白的piwi亞家族，組裝成pirna相關的沉默復合體(pirisc)，以發揮其生物學功能。piwi-pirna通路在沉默轉位因子、組裝端粒保護復合體、調節胚胎發育、維持基因組穩定性和完整性等方面發揮著重要作用。近年來，pirna在多種惡性腫瘤(如胃癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌和結直腸癌)和多種疾病(如生殖系統、心血管和神經系統疾病)中表達異常，這表明pirna可能作為潛在的診斷標志物和預后指標。因此，靈敏、準確地檢測pirna在臨床診斷和腫瘤學研究中具有重要意義。

2、回文序列是一種反向重復的核酸片段，廣泛存在于多種生物的基因組中，參與轉錄終止、dna復制和染色體易位等多種生物過程。回文序列具有分子間自雜交的有趣特性，無需任何輔助探針，大大簡化了探針的設計，減少了背景干擾。此外，自雜交dna的3'回文端可以作為核酸測定的引物。適配體是一種rna序列，它可以與無毒、可滲透的小分子熒光團結合，并在結合后將其熒光增強多個數量級。與非序列特異性插入染料(如溴化乙啶和sybr染料)相比，rna適配體-熒光團復合物具有量子產率高、光穩定性增強、成本低、背景干擾小等特點。不同的rna適配體-熒光基團對(如玉米-dfho、西蘭花-dfhbi-1t、孔雀石綠適配體-mg和芒果-to1-biotin)已被報道用于生物標志物的無標記檢測。

3、pirna檢測的傳統檢測方法包括下一代測序(ngs)、定量聚合酶鏈反應(qrt-pcr)和微陣列分析，但它們通常存在靈敏度低、特異性差、試劑使用量大、操作繁瑣和溫控儀器昂貴等問題。另外，幾種基于光電化學和熒光測量的新型生物傳感器已被開發用于pirna檢測。光電化學生物傳感器的過程耗時長，操作繁瑣，如需要修飾電極的制作和光敏材料的制備等。熒光生物傳感器集成了不同的核酸擴增方法(如催化發夾組裝(cha)、滾環擴增(rca)、連接酶鏈反應(lcr)和鏈置換擴增(sda))，以促進痕量pirna的靈敏檢測。雖然這些方法具有易于操作和靈敏度增強的優點，但它們通常采用熒光團(如cy5.5、cy3、fam和量子點)和淬滅劑(如bhq)修飾探針作為信號輸出，并且由于熒光不完全猝滅而產生高背景信號。因此，迫切需要開發準確、靈敏的pirna檢測生物傳感器。

技術實現思路

1、本發明的目的是提供一種雙向聚合-轉錄擴增編碼的雙色熒光生物傳感器用于無標記和無引物檢測多種pirna，該方法具有單堿基辨別能力和單細胞敏感性，可進一步應用于測定pirna在不同細胞系中的表達水平，以及健康個體和乳腺癌患者組織中pirna水平的區分，為pirna相關的臨床診斷和治療提供了有力的平臺。

2、在此，我們開發了一種雙向聚合轉錄擴增編碼的雙色熒光生物傳感器，用于無標記和無引物檢測多種pirna。該傳感器具有擴增效率高、特異性好、背景信號低等特點，無需外源引物設計。它能以單細胞靈敏性的定量細胞中pirna的表達水平，并能區分健康個體和乳腺癌患者組織中pirna的表達。

3、本發明提供了一種雙向聚合-轉錄擴增編碼的用于無標記和無引物檢測多種pirna的雙色熒光生物傳感器，所述傳感器包括：發夾探針1(hp1)、發夾探針2(hp2)、kf聚合酶、t7?rna聚合酶、dfhbi-1t、mg；

4、將發夾探針1(hp1)和/或發夾探針2(hp2)，和樣品溶液、kf聚合酶混合孵育后，添加t7?rna聚合酶、dfhbi-1t、mg進行孵育后，檢測樣品中的pirna-36026和/或pirna-36743。

5、在本發明的一種實施方式中，所述發夾探針1(hp1)序列為：gtg?tgg?gag?cccacactc?tac?tcgaca?gatacgaatatc?tgg?acc?cga?ccg?tct?ccc?aca?cga?ctaatacgactcactatagggattacaccatgg?ggc?ctaat?tag?tcgacta。

6、在本發明的一種實施方式中，所述發夾探針2(hp2)序列為：ggg?gat?ccattc?gttacc?tgg?ctc?tcg?cca?gtc?gggatc?ccc?cgg?ctaatacga?ctc?actatagggactacactacggaaa?cat?tag?ccg?gcta。

7、在本發明的一種實施方式中，所述pirna-36026序列為ggc?cccaug?gug?uaauggucagcacuc。

8、在本發明的一種實施方式中，所述pirna-36743序列為：guu?ucc?guagug?uag?ugggucauc?acg?uuc?gcc。

9、在本發明的一種實施方式中，所述發夾探針1(hp1)、發夾探針2(hp2)添加的濃度比為：1：1。

10、在本發明的一種實施方式中，所述kf聚合酶的添加量為2.5u，所述t7?rna聚合酶的添加量為10u-50u，所述dfhbi-1t的添加量為10μm，所述mg的添加量為10μm。

11、在本發明的一種實施方式中，發夾探針1、發夾探針2添加的濃度為50nm-250nm。

12、在本發明的一種實施方式中，所述生物傳感器中還包含緩沖液；所述緩沖液為nebuffer2緩沖液、rnapol反應緩沖液；所述生物傳感器中還含有dntps、rntp。

13、在本發明的一種實施方式中，將發夾探針1(hp1)和/或發夾探針2(hp2)，和樣品溶液、kf聚合酶混合后孵育的條件為：37℃條件下孵育10-50min；

14、添加t7?rna聚合酶、dfhbi-1t、mg進行孵育的條件為：37℃條件下孵育30-70min。

15、本發明還提供了一種非診斷目的的利用上述生物傳感器的檢測多種pirna的方法，所述方法包括以下步驟：

16、(1)將樣品溶液、發夾探針1(hp1)、發夾探針2(hp2)、nebuffer?2緩沖液、dntps、kf聚合酶進行孵育；

17、(2)向步驟(1)得到的孵育產物中，添加rnapol反應緩沖液、mgso4、rntp、t7?rna聚合酶、dfhbi-1t和10μm?mg進行孵育后，檢測樣品中的pirna-36026和/或pirna-36743。

18、在本發明的一種實施方式中，所述發夾探針1(hp1)序列為：gtg?tgg?gag?cccacactc?tac?tcgaca?gatacgaatatc?tgg?acc?cga?ccg?tct?ccc?aca?cga?ctaatacgactcactatagggattacaccatgg?ggc?ctaat?tag?tcgacta。

19、在本發明的一種實施方式中，所述發夾探針2(hp2)序列為：ggg?gat?ccattc?gttacc?tgg?ctc?tcg?cca?gtc?gggatc?ccc?cgg?ctaatacga?ctc?actatagggactacactacggaaa?cat?tag?ccg?gcta。

20、在本發明的一種實施方式中，所述pirna-36026序列為ggc?cccaug?gug?uaauggucagcacuc。

21、在本發明的一種實施方式中，所述pirna-36743序列為：guu?ucc?guagug?uag?ugggucauc?acg?uuc?gcc。

22、在本發明的一種實施方式中，步驟(1)中的孵育條件：37℃條件下孵育10-50min；步驟(2)中的孵育條件：37℃條件下孵育30-70min。

23、在本發明的一種實施方式中，所述發夾探針1(hp1)、發夾探針2(hp2)添加的濃度比為：1：1；所述kf聚合酶的添加量為2.5u，所述t7?rna聚合酶的添加量為10u-50u，所述dfhbi-1t的添加量為10μm，所述mg的添加量為10μm。

24、在本發明的一種實施方式中，發夾探針1、發夾探針2添加的濃度為50nm-250nm。

25、在本發明的一種實施方式中，所述檢測多種pirna的方法是通過檢測dfhbi-1t的熒光強度和mg的熒光強度實現的，所述dfhbi-1t的熒光強度與pirna-36026濃度呈正相關，回歸方程為f＝1287.33+72.74lg?c(r2＝0.9987)；

26、mg信號與pirna-36743濃度的對數呈良好的線性相關，方程為f＝1236.29+66.14lg?c(r2＝0.9973)。

27、本發明還提供了上述生物傳感器在制備檢測pirna-36026和/或pirna-36743水平的試劑盒中的應用。

28、本發明還提供了上述生物傳感器或上述檢測方法在檢測pirna-36026和/或pirna-36743水平中的應用，所述應用以非疾病的診斷與治療為目的。

29、本發明提出一種雙向聚合-轉錄擴增編碼的雙色熒光生物傳感器用于無標記和無引物檢測多種pirna的靈敏檢測法，該方法具體步驟如下：

30、步驟1，將含不同濃度pirna-36026/pirna-36743、100nm發夾探針hp1/hp2、1×nebuffer?2、200μm?dntps、2.5u?kf聚合酶的10μl反應溶液，在37℃下孵育30分鐘,80℃終止孵育10分鐘。

31、其中，pirna是與piwi蛋白相作用的核糖核酸；

32、kf聚合酶是dna聚合酶i的n末端截短物，它保留了dna聚合酶活性，但失去了5′→3′核酸外切酶活性；

33、nebuffer?2緩沖液為kf聚合酶產品中自帶的反應緩沖液；

34、dntp混合液是由超純datp、dctp、dgtp和dttp組成的等摩爾溶液。

35、步驟2，將反應產物加入含有1×rnapol反應緩沖液、10mm?mgso4、1mm?rntp、30ut7?rna聚合酶、10μm?dfhbi-1t和10μm?mg的反應溶液中在37℃下孵育1小時后進行后續測量。

36、t7?rna聚合酶是一種dna依賴的rna聚合酶，對t7噬菌體啟動子具有高度特異性；

37、rnapol反應緩沖液為t7?rna聚合酶產品中自帶的反應緩沖液；

38、atp是腺嘌呤核苷三磷酸；

39、mg和dfhbi-1t是rna適配體的熒光染料。

40、所述nebuffer?2緩沖溶液包括50mm?nacl,10mm?tris-hcl,10mm?mgcl2,1mm?dtt。

41、所述rnapol反應緩沖液包括40mm?tris-hcl,6mm?mgcl2,2mm亞精胺，10mm?dtt,ph7.9。

42、所述pirna-36026序列為ggc?cccaug?gug?uaaugg?ucagcacuc。

43、所述pirna-36743序列為：guu?ucc?guagug?uag?ugg?gucauc?acg?uuc?gcc。

44、所述探針hp1序列為：gtg?tgg?gag?ccc?aca?ctc?tac?tcg?aca?gatacg?aat?atctgg?acc?cga?ccg?tct?ccc?aca?cga?ctaata?cga?ctc?act?ata?ggg?attaca?ccatgg?ggcctaat?tag?tcgacta。

45、所述探針hp2序列為：ggg?gat?cca?ttc?gtt?acc?tgg?ctc?tcg?cca?gtc?ggg?atcccc?cgg?ctaatacga?ctc?actataggg?actaca?cta?cggaaa?cat?tag?ccg?gcta。

46、在本發明的一種實施方式中，所述nebuffer?2緩沖溶液包括50mm?nacl,10mmtris-hcl,10mm?mgcl2,1mm?dtt。

47、在本發明的一種實施方式中，所述rnapol反應緩沖溶液包括40mm?tris-hcl,6mmmgcl2,2mm亞精胺，10mm?dtt,ph?7.9。

48、在本發明的一種實施方式中，所述pirna-36026序列為ggc?cccaug?gug?uaauggucagcacuc。

49、在本發明的一種實施方式中，所述pirna-36743序列為：guu?ucc?guagug?uag?ugggucauc?acg?uuc?gcc。

50、在本發明的一種實施方式中，所述hp1序列為：gtg?tgg?gag?cccacactc?tac?tcgaca?gatacg?aatatc?tggacc?cga?ccg?tct?ccc?aca?cga?ctaata?cga?ctc?actatagggattacaccatgg?ggc?ctaattag?tcgacta。

51、在本發明的一種實施方式中，所述探針hp2序列為：ggg?gat?ccattc?gttacc?tggctc?tcg?cca?gtc?ggg?atc?ccc?cgg?ctaata?cga?ctc?actata?ggg?actaca?ctacggaaacattag?ccg?gcta。

52、本發明還提供了上述雙向聚合-轉錄擴增編碼的雙色熒光生物傳感器用于無標記和無引物檢測多種pirna的應用，該方法應用于靈敏地檢測pirna，pir-36026的檢測限為82.08am，pir-36743的檢測限為44.44am。

53、有益效果

54、開發了一種雙向聚合轉錄擴增編碼雙色熒光生物傳感器，用于無標記和無引物檢測活細胞和乳腺組織中的多種pirna。與現有的pirna檢測方法相比，該生物傳感器具有顯著的優點:

55、(1)含有回文片段的發夾探針可以作為靶標識別單元、聚合引物和轉錄模板，不需要任何外源引物，有效避免了引物二聚體誘導的非特異性擴增，具有極低的背景；

56、(2)雙向聚合-轉錄擴增反應可有效提高檢測靈敏度；

57、(3)與經典熒光染料(如sybr染料)相比，點亮的rna適配體有助于pirna的無標記檢測，具有高信噪比。

58、由于雙向擴增的高擴增效率，該生物傳感器具有高靈敏度和單堿基錯配判別能力。它能夠以單細胞靈敏度定量pirna表達，區分癌細胞與正常細胞，區分乳腺癌患者與健康個體。重要的是，所提出的生物傳感器可以通過簡單地改變發夾探針的目標識別區域來擴展到檢測其他pirna，為pirna相關的臨床診斷提供了一個多功能平臺。