本發明涉及l-纈氨酸,具體為一種提高l-纈氨酸發酵產率和糖酸轉化率的方法。
背景技術:
1、纈氨酸化學名稱為2-氨基-3-甲基丁酸,屬于支鏈氨基酸,是人體必需的8種氨基酸和生糖氨基酸,它能促進身體正常生長,修復組織,調節血糖,并提供需要的能量。可用異丁醛作原料合成。為白色結晶或結晶性粉末,在水中溶解,在乙醇中幾乎不溶。
2、纈氨酸被廣泛應用于醫藥、食品、飼料和化妝品等領域,特別是在醫藥領域,纈氨酸可用于與其他必需氨基酸配制成復合氨基酸輸液,尤其是高支鏈氨基酸輸液及口服液,不僅可以提高人體免疫力,還能促進病人康復及手術后復原。
3、l-纈氨酸的化學合成法的特點是生產成本高,反應復雜,步驟多,且有許多副產物,例如異丁醛與氨生成氨基異丁醇,再與氰化氫合成氨基異丁腈,然后水解得到纈氨酸,外消旋體的拆分也有多種方法,例如用酰基-dl-氨基酸的酶進行水解,再利用游離氨基酸與酰化體的溶解度差進行分離。
4、微生物發酵法生產l-纈氨酸具有原料成本低,反應條件溫和及可大規模生產等優點,是一種非常經濟的生產方法。
5、然而現有的l-纈氨酸發酵產率和發酵菌的糖酸轉化率均相對較低,限制了l-纈氨酸的產量,提高了成本,降低了經濟效益。
6、基于此,我們提出了一種提高l-纈氨酸發酵產率和糖酸轉化率的方法,希冀解決現有技術中的不足之處。
技術實現思路
1、(一)解決的技術問題
2、針對現有技術的不足,本發明提供了一種提高l-纈氨酸發酵產率和糖酸轉化率的方法。
3、(二)技術方案
4、為實現上述的目的,本發明提供如下技術方案:
5、一種提高l-纈氨酸發酵產率和糖酸轉化率的方法,將l-纈氨酸發酵菌接種至含有促進劑的發酵培養基中進行發酵培養,得到l-纈氨酸;
6、所述促進劑包括:螯合物、b族維生素;
7、所述螯合物、b族維生素混合質量比為:3:1-1.6。
8、作為進一步的技術方案,所述促進劑在發酵培養基中含量為0.5-10.5g/l。
9、作為進一步的技術方案,所述螯合物制備方法為:
10、首先,將硫酸鋅、氯化鎂依次添加到蒸餾水中,在室溫條件下,以500r/min的轉速進行攪拌混合至硫酸鋅、氯化鎂全部溶解,得到混合水溶液;
11、將羥基蛋氨酸、助劑混合物添加到混合水溶液中,調節溫度至78℃,以120r/min的轉速進行保溫攪拌40min,然后再添加氫氧化鈉溶液,調節溫度至80℃,以200r/min的轉速繼續保溫攪拌2小時,再進行靜置1小時,然后進行抽濾,水洗至中性,真空干燥,得到螯合物;
12、所述混合水溶液中硫酸鋅質量分數為2-3%,其中,氯化鎂與硫酸鋅摩爾比為1:1;
13、所述硫酸鋅、氯化鎂、氯化鎂羥基蛋氨酸、助劑混合物、氫氧化鈉摩爾比為1:1:3:1:3;
14、所述真空干燥溫度為55℃;
15、真空干燥時間為1小時。
16、作為進一步的技術方案:所述助劑混合物制備方法為:
17、首先,將β-丙氨酸添加到甲醇中,攪拌10min,然后再添加氫氧化鈉溶液,調節溫度至30℃,保溫攪拌20min,再添加l-組氨酸,繼續攪拌40min,然后進行旋蒸干燥,得到助劑混合物;
18、所述β-丙氨酸、甲醇混合質量比為1:10-12;
19、β-丙氨酸與氫氧化鈉溶液混合質量比例為1:4-5;
20、所述氫氧化鈉溶液質量分數為12.5%;
21、所述β-丙氨酸與l-組氨酸混合質量比為3:1。
22、作為進一步的技術方案:所述l-纈氨酸發酵菌為谷氨酸棒桿菌。
23、作為進一步的技術方案,所述發酵培養基的成分為:葡萄糖45-58g/l,硫酸錳1-1.5g/l,玉米漿12-15ml/l,氯化銨1-2g/l,磷酸二氫鉀1-1.5g/l,檸檬酸鈉0.8-1.2g/l,鉬酸鈉0.002-0.005g/l,促進劑0.5-10.5g/l,活性多肽0.1-0.15g/l;
24、其中,發酵培養基的ph值為6.9-7.0;
25、所述活性多肽制備方法為:
26、將黑斑蛙進行脫皮,得到黑斑蛙皮,將黑斑蛙皮在去離子水中浸泡1小時,然后再反復清洗10min,取出,切碎,得到黑斑蛙碎皮;
27、將黑斑蛙碎皮與異丙醇進行混合到一起,真空浸漬攪拌4小時,然后進行過濾,洗滌,低溫干燥,得到與處理黑斑蛙碎皮;
28、其中,黑斑蛙碎皮與異丙醇混合質量比為1:12;
29、真空浸漬溫度為4℃,真空度為0.2pa;
30、低溫干燥溫度為4℃;
31、將預處理黑斑蛙碎皮與去離子水進行混合均勻,然后添加到打漿機中,進行打漿處理20min,得到碎皮漿液;
32、預處理黑斑蛙碎皮與去離子水混合質量比為1:4;
33、向碎皮漿液中添加中性蛋白酶,進行酶解處理8小時,得到酶解液;
34、以碎皮漿液總質量計,中性蛋白酶添加量2%;其中酶解處理的溫度為42℃;
35、對酶解液進行滅酶處理:在95℃水浴中加熱10min;
36、經過滅酶處理后,再進行離心處理,取上清液;
37、其中,離心處理轉速為10000r/min,時間為10min;
38、對上清液進行冷凍干燥,得到活性多肽。
39、作為進一步的技術方案,所述玉米漿制備方法為:
40、首先,稱取新鮮玉米粒,將新鮮玉米粒添加到亞硫酸溶液中,進行浸泡處理,其中,浸泡處理分兩個階段,包括普通浸泡階段與真空浸泡階段;
41、其中,先進行普通浸泡階段再進行真空浸泡階段,普通浸泡階段時間為35-40小時,真空浸泡時間為10-15小時;
42、其中普通浸泡階段溫度為48℃,真空浸泡階段溫度為51℃,真空度為0.1-0.2pa;
43、經過浸泡完成后,再進行過濾,濾膜孔徑為0.055μm,得到過濾液;
44、對過濾液進行濃縮,得到波美度為20的玉米漿,再進行滅菌,即可;
45、所述亞硫酸溶液質量分數為0.22-0.26%;
46、其中,玉米粒、亞硫酸溶液混合比例為20-25g:230ml。
47、作為進一步的技術方案:所述滅菌為采用121℃蒸汽滅。
48、作為進一步的技術方案:所述發酵的溫度為30-36℃,發酵時間為30-35小時。
49、作為進一步的技術方案:所述b族維生素包括維生素b1與維生素b12;
50、所述維生素b1與維生素b12混合質量比為1:3。
51、(三)有益效果
52、與現有技術相比,本發明提供了一種提高l-纈氨酸發酵產率和糖酸轉化率的方法,具備以下有益效果:
53、本發明提供的l-纈氨酸發酵方法,對于l-纈氨酸的發酵產量與糖酸轉化率均具有明顯的提高,從而提高了經濟效益。
54、本發明技術方案中的l-纈氨酸通過谷氨酸棒狀桿菌進行發酵生產而得到,采用現有的發酵方法會存在糖酸轉化率不高的問題,因此,本發明通過對發酵培養基成分以及用量進行了改進,通過引入了特制的玉米漿與促進劑,能夠大幅度的改善了糖酸轉化率不高的問題,明顯的提高了糖酸轉化率,進而提高了l-纈氨酸的產量。
55、通過促進劑的引入,能夠起到對谷氨酸棒桿菌代謝調控具有一定程度的影響,通過調控,能夠改變特定酶活力的高低,進而,起到重新分配碳架物質在細胞內的流向,能夠優先的分配到l-纈氨酸合成路徑中,進而提高l-纈氨酸的發酵產量。
56、l-纈氨酸合成主要以丙酮酸為前體物質,經過一系列的反應,最終合成l-纈氨酸,因此,丙酮酸會影響到最終l-纈氨酸的產量,本發明在發酵培養基中,主要通過促進劑中螯合物與b族維生素的協同作用,能夠加強表達丙酮酸生物合成途徑關鍵酶基因(包括:轉酮醇酶基因tkt、轉醛酶基因tal、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pck)增加合成丙酮酸前體物的供應,從而加速了丙酮酸的合成,為后續l-纈氨酸合成的一系列反應打下牢固的基礎。在發酵過程中,促進劑與玉米漿中的玉米核黃素的配合會對乙酰羥酸合成酶、乙酰羥酸異構還原酶、二羥酸脫水酶和支鏈氨基酸轉氨酶的活性具有一定的提高效果,而乙酰羥酸合成酶、乙酰羥酸異構還原酶、二羥酸脫水酶和支鏈氨基酸轉氨酶又參與l-纈氨酸的一系列合成反應,加速了反應的進行,尤其是提高了糖酸轉化率,能夠促進l-纈氨酸的合成的進程,縮短了整個發酵周期,起到了在有限的時間內,大幅度的提高了l-纈氨酸的產率,經濟效益明顯。
57、本發明通過引入了活性多肽,作為小分子蛋白質片段,含有豐富的氮源和生長因子,能夠直接被發酵菌吸收利用,從而促進發酵菌的快速生長和繁殖。同時,它們還能激活發酵菌菌體內的酶系統,加速代謝過程,為l-纈氨酸的合成提供更多的前體和能量。
58、由于l-纈氨酸的生物合成是一個復雜的代謝網絡,涉及多個中間產物和酶的參與,同構引入的本發明制備的活性多肽能夠通過調控關鍵酶的活性和表達水平,優化代謝流向,使更多的碳源流向l-纈氨酸的合成路徑,從而提高產量,此外,還可能減少副產物的生成,進一步提高l-纈氨酸的純度。
59、由于本發明制備的活性多肽具有一定的改善細胞膜通透性的功能,這有助于營養物質進入發酵菌細胞和代謝產物排出細胞,從而提高整個發酵過程的效率,特別是在l-纈氨酸的分泌階段,增強的細胞膜通透性可以促進l-纈氨酸的快速釋放到胞外,避免其在細胞內積累造成的反饋抑制。