本發明屬于生物工程，涉及一種具有良好抑菌效果的營養型微生物菌劑的制備方法。
背景技術：
1、 ε-聚賴氨酸（ ε-poly-l-lysine，簡寫 ε-pl，下同）是目前國際范圍內獲得批準且被廣泛使用的微生物來源的天然食品防腐劑。 ε-pl是由幾個至幾十個l-賴氨酸單體通過其 α-羧基和 ε-氨基縮合而成的多陽離子同型氨基酸聚合物，其中關鍵合酶是聚賴氨酸合酶，編碼基因是 pls。 ε-pl因富含陽離子和異形肽鍵（ ε型肽鍵）而展現出對g+細菌、g-細菌、酵母菌、霉菌和病毒的廣譜抑制活性。同時，它還具有水溶性好、耐高溫、無毒性、可食用且可生物降解等特點。因此， ε-pl被首先開發成防腐保鮮劑應用于食品領域。此外，作為陽離子生物聚合物，它還被用作藥物載體、基因載體、保濕材料和生物芯片等。在我國， ε-聚賴氨酸也被國家衛生計生委正式批準用于果蔬及果蔬汁制品、米面及其制品、雜糧制品、肉及肉制品、調味品、飲料、焙烤食品等食品防腐保鮮的應用，是一種營養型抑菌劑。
2、乳酸鏈球菌素（nisin，下同）也是一種被廣泛應用于食品工業中的安全天然的防腐劑。nisin是一種由乳酸鏈球菌產生的陽離子多肽，具有廣泛的抗菌活性，可有效地抑制大多數革蘭氏陽性細菌，對其孢子有強烈的抑制作用且對人體無副作用。nisin表現了廣泛的對革蘭氏陽性菌的抑制作用，包括腐敗和食源性病原體，如葡萄球菌、桿菌、肉毒梭菌、單增李斯特菌和多種抗藥性細菌。nisin于1969年被糧農組織與世界健康組織（fao/who）確定為安全的食品添加劑，已被50多個國家用作食品防腐劑。nisin已被多國批準，其廣泛應用在食品工業中作為一種安全高效的食品防腐劑已有幾十年的歷史，廣泛應用于各種食品中。我國批準其列入國標gb2760-86的1990年增補品種中，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品中。
3、 ε-pl和nisin都是對環境友好的天然抑菌成分，抑菌效果顯著，同時它們都是目前被批準加入食品中的生物防腐劑，安全性高，抑菌效果在之前的許多研究中被證實。對于這兩種天然成分的復配，有助于提高抑菌劑的抑菌效果，增加抑菌譜，減少用量而降低成本。
技術實現思路
1、本發明提供了一種具有抑菌效果的營養型微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟：（1）將 ε-聚賴氨酸編碼基因在枯草芽孢桿菌中進行異源表達，獲得產生 ε-聚賴氨酸的重組質粒pma5- pls。（2）在乳酸鏈球菌中過表達 asnh基因，獲得高產乳酸鏈球菌素的重組質粒mg36e-asnh。（3）將兩種質粒pma5- pls和mg36e- asnh經發酵培養后得到的菌劑按比例復配，采用checkerboard法獲得了最佳抑菌效果的復配比例。
2、優選的，所述重組質粒pma5- pls是以pma5為載體，連接聚賴氨酸合酶 pls的編碼基因后轉化至枯草芽孢桿菌wb800中進行表達。
3、優選的，所述重組質粒pma5- pls的培養條件為初始ph?7.0，溫度32℃，接種量5%，震蕩速度200?rpm。培養基的組分為玉米粉15?g/l，大豆粉15?g/l，kno3?5?g/l，mgso4?2?g/l，kh2po4?0.5?g/l，l-賴氨酸?10?g/l。
4、優選的，所述重組質粒pma5- pls的培養時間為36小時，產生的 ε-聚賴氨酸濃度約為501.8?mg/l。
5、優選的，所述重組質粒pmg36e-asnh是以pmg36e為載體，連接天冬酰胺合成酶 asnh基因后制備而成。
6、優選的，所述重組質粒pmg36e-asnh是以乳酸鏈球菌2021rs為宿主菌，所含 asnh基因為多拷貝基因，拷貝數為6拷貝/基因組。
7、優選的，所述重組質粒pmg36e-asnh的培養條件為初始ph?7.0，溫度30℃，接種量6%，震蕩速度220?rpm。培養基組分為酵母提取物15?g/l，大豆粉15?g/l，蔗糖?20?g/l，nacl1.5?g/l，mgso4?1.5?g/l，kh2po4?1?g/l。
8、優選的，所述重組質粒pmg36e-asnh的培養時間為48小時，產生的乳酸鏈球菌素的效價為7216?iu/ml。
9、優選的，所述兩種質粒pma5- pls和mg36e- asnh經發酵后得到的菌劑按比例復配，具有最佳抑菌效果的復配比例為1:12。
10、實施方式
11、實施例1：重組質粒pma5- pls的制備
12、（1）取攜帶 pls基因的白色鏈霉菌，采用基因組試劑盒提取白色鏈霉菌的基因，pcr擴增 pls基因；（2）取攜帶pma5載體的 e.?coli?top10，用質粒小提試劑盒提取載體pma5；（3）分別對 pls基因和載體pma5進行雙酶切后進行連接，連接成功后通過熱激法將重組質粒pma5- pls轉化到芽孢桿菌wb800中進行表達。
13、實施例2：重組質粒pma5- pls的發酵培養
14、種子培養基為lb培養基，主要成分為蛋白胨10?g/l，酵母粉5?g/l，氯化鈉10?g/l。發酵培養基的組分為玉米粉15?g/l，大豆粉15?g/l，kno3?5?g/l，mgso4?2?g/l，kh2po4?0.5g/l，l-賴氨酸?10?g/l。
15、培養條件為初始ph?7.0，溫度32℃，接種量5%，震蕩速度200?rpm，培養時間為36小時。
16、實施例3： ε-聚賴氨酸含量以及轉化率的測定
17、按照itzhaki法將聚賴氨酸標品配成20，40，60，80，100?μg/ml的溶液，取?10?ml不同濃度的聚賴氨酸溶液分別與10?ml甲基橙溶液(l?mmol/l）混合，用0.1?mol/l的磷酸緩沖液加甲基橙作為空白對照，將各混合溶液于30℃水浴振蕩30?min后離心?15?min，取上清液l?ml，稀釋50倍后在465?nm波長的分光光度計中測定吸光值，并繪制標準曲線。取適量經離心去菌后的待測樣品，按itzhaki方法計算聚賴氨酸產生量。
18、 ε-聚賴氨酸的轉化率公式如下；
19、
20、式中：m ε-聚賴氨酸＝反應液中 ε-聚賴氨酸的濃度×反應液的體積，δml-賴氨酸＝(反應液中初始l-賴氨酸的濃度-反應液中剩余l-賴氨酸的濃度)×反應液的體積。
21、實施例4：重組質粒pmg36e-asnh的制備
22、在結合pmg36e表達載體的開放閱讀框，在多克隆位點處的酶切位點進行引物設計，擴增 asnh基因，并進行電泳檢測和測序驗證。
23、（1）根據genbank報道的 asnh序列，由基因公司合成該基因片段；（2）取攜帶pmg36e載體的 e.?coli?top10，用質粒小提試劑盒提取載體pmg36e；（3）分別對 asnh基因和載體pmg36e進行雙酶切后進行連接，連接成功后通過電轉法將重組質粒pmg36e-asnh轉化到乳酸鏈球菌2021rs中進行表達。
24、實施例5：重組質粒pmg36e-asnh的發酵培養
25、種子培養基的主要成分為：酵母提取物?15?g/l，蛋白胨15?g/l，蔗糖?10?g/l，nacl?1?g/l，mgso4?1?g/l，kh2po4?1?g/l。發酵培養基的主要成分為酵母提取物15?g/l，大豆粉15?g/l，蔗糖?20?g/l，nacl?1.5?g/l，mgso4?1.5?g/l，kh2po4?1?g/l。
26、培養條件為初始ph?7.0，溫度30℃，接種量6%，震蕩速度220?rpm，培養時間48小時。
27、實施例6：微生物菌劑復配的抑菌效果檢測
28、以常見致病菌（如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等）為抑菌試驗對象，將致病菌接種至營養肉湯培養基中培養24?h，菌液離心后傾去上清液，回收沉淀的菌體，加入無菌生理鹽水混勻，制備成菌懸液備用。吸取1?ml制備好的菌懸液，與含瓊脂的液體培養基混合后倒入培養皿中，搖勻，凝固后用7?mm打孔器打孔，分別加入單含質粒pma5- pls的菌液、單含質粒mg36e- asnh的菌液以及含兩種質粒的不同復配比例的菌液，以無菌水為空白對照，適溫條件下培養20?h后觀察并記錄抑菌圈大小，抑菌圈最大時所使用的菌液濃度和復配比例為理想值。
29、采用checkerboard法檢測兩種質粒pma5- pls和mg36e- asnh的協同抑菌效果。計算公式如下：
30、fici值=（質粒pma5- pls與mg36e- asnh聯用/質粒pma5- pls單用）+（質粒pma5- pls與mg36e- asnh聯用/質粒mg36e- asnh單用），其中fic?≤?0.5時為有協同作用，0.5＜fici≤1時為有疊加作用。