一種植物防御素及其編碼基因和用途

本發明涉及植物保護領域，特別是涉及植物防御素及其編碼基因和用途。

背景技術：

1、植物在生長過程中隨時會受到各種病原菌的侵染，由于生存競爭的需要，在長期進化過程中，植物體形成了一套天然防御體系，自身會產生一些物質來與外源侵襲物對抗，植物抗真菌肽就是其中的一類，它們可抑制真菌生長或殺死真菌。抗真菌肽由于其重要的理論及應用價值而逐漸成為研究熱點之一。其中植物防御素(plant?defensin)是目前發現最多的一類植物抗真菌肽。

2、植物防御素是一類由45-55個氨基酸殘基組成的陽離子生物活性肽，它廣泛分布于植物的花、莖、葉、果實、塊根和種子中，是植物防御外來病原生物侵染屏障的重要組成之一。植物防御素氨基酸一級結構中含有8個保守的cys，形成4對鏈內二硫鍵。這4對二硫鍵配對的模式通常是cys1-cys8、cys2-cys5、cys3-cys6、cys4-cys7，其中cys1-cys8、cys2-cys5這兩對二硫鍵在植物防御素中最保守。這些二硫鍵使防御素對蛋白酶以及極端的ph值和溫度高度穩定。

3、植物防御素的生物活性多種多樣，具有抗菌功能、抑制酶的活性、抑制癌細胞生長與增殖、離子通道阻斷劑等作用，它們不但參與抵抗外源病原的侵染，還參與了植物對外界不良環境的抗逆過程。

4、目前，已經從各種植物組織中鑒定出數百種植物防御素，不同植物防御素生物活性的活性差異較大，比如具有不同的抗菌功能、抑制酶的活性、抑制癌細胞生長與增殖活性、離子通道阻斷功能等，所以尋找新的植物防御素具有重要的意義。

技術實現思路

1、目前發現新的植物防御素的技術主要有三種，第一種技術是從生物材料中分離純化植物防御素，對其進行n-端測序，或設計簡并引物獲取其cdna序列并推導其氨基酸組成；第二種技術是從數據庫中獲得植物防御素的同源序列，設計簡并引物獲取其cdna序列并推導其氨基酸組成；第三種技術是通過生物信息學方法從物種基因組中尋找發現植物防御素基因序列，并推導其氨基酸組成。本發明采用的是第一種技術，以紫藤屬植物(諸如中國紫藤wisteria?sinensis)為材料，從其中分離純化一種新的植物防御素，并對其性質進行研究，本發明的植物防御素具有顯著的抑制真菌活性。

2、經研究，本發明提供如下技術方案：

3、本發明的第一方面提供了一種分離的植物防御素多肽，所述分離的植物防御素多肽包含與seq?id?no:1和/或seq?id?no:2所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。發明人發現，本發明的分離的植物防御素多肽具有顯著的抑制真菌活性。

4、在本發明中，涉及的術語“多肽”包括肽或蛋白質。

5、在本發明的一些實施方式中，“植物防御素多肽”可以與“抗真菌肽”互換使用。

6、在本發明的一些實施方式中，分離的植物防御素多肽包含與seq?id?no:1所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性的氨基酸序列。

7、在本發明的一些實施方式中，分離的植物防御素多肽包含與seq?id?no:2所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性的氨基酸序列。

8、在本發明的一些實施方式中，分離的植物防御素多肽包含與seq?id?no:1和seqid?no:2所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性的氨基酸序列。

9、在本發明中，用于確定序列同一性的方法可以是本領域普通技術人員知曉的任何方法，諸如blast比對。

10、本發明的第二方面提供了一種分離的核苷酸序列，所述分離的核苷酸序列包含與seq?id?no:3和/或seq?id?no:4所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。在本發明的實施方式中，所述分離的核苷酸序列編碼以上所述的分離的植物防御素多肽。

11、在本發明的一些實施方式中，分離的核苷酸序列包含與seq?id?no:3所示的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性的核苷酸序列。

12、在本發明的一些實施方式中，分離的核苷酸序列包含與seq?id?no:4所示的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性的核苷酸序列。

13、在本發明的一些實施方式中，分離的核苷酸序列包含與seq?id?no:3和seq?idno:4所示的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性的核苷酸序列。

14、在本發明中，涉及的術語“核苷酸序列”可以與“多核苷酸序列”或“核酸分子”互換使用，包括dna(諸如cdna)或rna(諸如mrna)或dna/rna雜合體形式。在本發明的一些實施方式中，分離的核苷酸序列是cdna和/或mrna。

15、在本發明的一些優選實施方式中，分離的核苷酸序列是cdna。

16、本發明的第三方面提供了一種從紫藤屬植物中獲得分離的植物防御素多肽的方法，包括以下步驟：

17、(1)將所述紫藤屬植物的器官或組織粉碎，然后過濾得濾液，將所述濾液在50℃-70℃下進行水浴30-60min后，離心，取上清液；采用以上溫度范圍的水浴處理，能夠去除大部分不耐熱雜質蛋白，以便于有效獲得所述分離的植物防御素多肽。

18、(2)將所述上清液進行陽離子交換層析處理，然后收集各峰的第一洗脫產物；

19、(3)將所述第一洗脫產物中具有抑制真菌活性的產物進行凝膠過濾層析處理，然后收集各峰的第二洗脫產物；

20、(4)將所述第二洗脫產物中具有抑制真菌活性的產物進行高效液相色譜處理，然后收集各峰的第三洗脫產物，所述第三洗脫產物中包含純度為95％以上的分離的植物防御素多肽。

21、發明人發現，本發明的方法中應用熱處理、陽離子交換層析、凝膠過濾層析和hplc技術等四步純化步驟，能夠得到純度95％以上、產率0.1％以上的植物防御素，克服了現有分離純化植物防御素技術步驟繁瑣、產率較低和效率不高的缺點，能夠簡單省時地獲得前面所述的分離的植物防御素多肽，獲得的植物防御素多肽純度達到95％以上，產率達0.1％以上，并且能夠有效抑制真菌活性。

22、在本發明中，紫藤屬植物包括中國紫藤(wisteria?sinensis)、短梗紫藤(wisteria?brevidentata?rehder)、多花紫藤(wisteriafloribunda(willd.)dc)、紫藤(wisteria?sinensis(sims)sweet)、白花紫藤(變型)(wisteria?sinensis(sims)sweetform.alba(lindl.)rehder&e.h.wilson)、紫藤(原變型)(wisteria?sinensis(sims)sweetform.sinensis)、白花藤蘿(wisteria?venusta?rehder&e.h.wilson)和藤蘿(wisteriavillosa?rehder)中至少一種。

23、在本發明的一些優選實施方式中，所述紫藤屬植物為紫藤(wisteria?sinensis(sims)sweet)。

24、在本發明中，分離的植物防御素多肽的紫藤屬植物器官或組織的來源包括但不限于種子，花，葉，莖和根等。在一些本發明的優選實施方式中，紫藤屬植物器官或組織的來源為紫藤屬植物的種子。在一些本發明的更優選的實施方式中，紫藤屬植物器官或組織的來源為紫藤(wisteria?sinensis(sims)sweet)的種子。

25、在本發明中，所有提及的濃度，除了特別說明的，都是指摩爾濃度。

26、在本發明的一些優選實施方式中，從紫藤屬植物中獲得分離的植物防御素多肽的方法包括以下步驟：在步驟(1)中，在50℃-70℃下進行水浴30-60min，以8000-15000rpm的轉速離心10-40min后，取上清液。經過此步驟處理，能夠更有效地去除植物組織中大部分不耐熱雜質蛋白，獲得分離的植物防御素多肽，而且獲得的植物防御素多肽的產率更高，純化效果更好。

27、在本發明的一些進一步優選實施方式中，在步驟(1)中，以12000rpm的轉速離心30min。

28、在本發明的一些優選實施方式中，從紫藤屬植物中獲得分離的植物防御素多肽的方法包括以下步驟：在步驟(2)中，采用ph?5.0-7.0的緩沖液平衡的陽離子交換層析柱，采用含有0.1-0.5m?nacl的ph?5.0-7.0的洗脫液洗脫；檢測波長λ為213-280nm，流速為0.5-1.5ml/min；然后收集各峰的第一洗脫產物，凍干后檢測抑制真菌活性。經過此步驟處理，能夠去除大部分帶負電的蛋白質，更有效地獲得分離的植物防御素多肽，而且獲得的植物防御素多肽的產率更高，純化效果更好。

29、更優選地，在步驟(2)中，平衡的陽離子交換層析柱的緩沖液為ph5.0-7.0的10-30mm?pb緩沖液。

30、更優選地，在步驟(2)中，洗脫液為含有0.1-0.5m?nacl的ph?5.0-7.010-30mm?pb洗脫液。

31、在本發明中，可以采用洗脫中常用的中性鹽洗脫液。中性鹽洗脫液優選為nacl溶液，成本低，效果好。

32、在本發明的一些更優選實施方式中，在步驟(2)中，采用ph?6.5的20mm?pb的緩沖液平衡的陽離子交換層析柱，采用含有0.1m-0.5mnacl的ph6.5的20mm?pb洗脫液洗脫；檢測波長為λ280nm，流速為1ml/min；然后收集各峰的第一洗脫產物，檢測抑制真菌活性。

33、在本發明的一些優選實施方式中，從紫藤屬植物中獲得分離的植物防御素多肽的方法包括以下步驟：在步驟(3)中，以8000-15000rpm的轉速離心10-40min后，上樣至ph5.0-7.0的緩沖液已平衡的凝膠過濾層析柱，再用ph?5.0-7.0的洗脫液洗脫，檢測波長λ213-280nm，流速為0.3-1ml/min；然后收集各峰的第二洗脫產物，檢測抑制真菌活性。經過此步驟處理，能夠更有效地獲得分離的植物防御素多肽，而且獲得的植物防御素多肽的產率更高，純化效果更好。

34、更優選地，在步驟(3)中，緩沖液為ph?5.0-7.0的10-30mm?pb緩沖液。

35、更優選地，在步驟(3)中，洗脫液為ph?5.0-7.0的10-30mm?pb洗脫液。

36、在本發明的一些更優選實施方式中，在步驟(3)中，采用ph?6.5的20mm?pb的緩沖液，以12000rpm的轉速離心30min后，上樣至用ph?6.5的20mm?pb的緩沖液平衡的凝膠過濾層析柱，再用ph?6.5的20mm?pb洗脫，檢測波長λ280nm，流速為0.5ml/min；然后收集各峰的第二洗脫產物，凍干后檢測抑制真菌活性。

37、在本發明的一些優選實施方式中，從紫藤屬植物中獲得分離的植物防御素多肽的方法包括以下步驟：在步驟(4)中，取具有抑菌活性的第二洗脫產物的凍干粉溶于含0.05％-0.15％的tfa溶液中，離心后上樣至rp?hplc柱，用極性有機溶劑進行梯度洗脫，hplc所用的緩沖液buffer?a為0.05％-0.15％tfa，buffer?b為100％極性有機溶劑，其中洗脫梯度為：0-10min，100％buffera；10-60min，0-60％buffer?b；流速為0.8-2ml/min，在檢測波長λ214nm和λ280nm下監測洗脫峰；然后收集各峰的第三洗脫產物。經過此步驟處理，能夠更有效地獲得前面所述的分離的植物防御素多肽，而且獲得的植物防御素多肽的最終產率達0.1％以上(第三洗脫產物中植物防御素多肽的質量/紫藤屬植物的器官或組織的質量)，純化的植物防御素多肽純度達95％以上。

38、更優選地，在步驟(4)中，極性有機溶劑為腈類極性有機溶劑，最優選為乙腈。

39、在本發明的一些更優選實施方式中，在步驟(4)中，取具有抑菌活性的第二洗脫產物的凍干粉溶于含0.1％的tfa溶液中，離心后上樣至rp?hplc柱，用乙腈進行梯度洗脫，hplc所用的緩沖液buffera為0.1％tfa，buffer?b為100％乙腈，其中洗脫梯度為：0-10min，100％buffera；10-60min，0-60％buffer?b；流速為1.5ml/min，在檢測波長λ214nm和λ280nm下監測洗脫峰；然后收集各峰的第三洗脫產物。

40、本發明的第四方面提供了一種構建體，其包含以上所述的分離的植物防御素多肽和/或以上所述的分離的核苷酸序列。利用本發明的構建體可以有效轉化重組細胞，并且通過培養轉化獲得的重組細胞能夠快速有效地制備以上所述的分離的植物防御素多肽。在本發明的一些實施方式中，所述構建體包含以上所述的分離的核苷酸序列。

41、在本發明中，構建體的實例包括但不限于質粒、粘粒、bac(細菌人工染色體)、yac(酵母人工染色體)、病毒、噬菌體、植物微型染色體、自主復制序列或其他任何能夠進行基因組整合或自主復制的線性或環狀單鏈或雙鏈dna序列。構建體可以通過本領域普通技術人員已知的多種方法進行裝配，所述方法包括但不限于重組dna技術、dna合成技術、pcr(聚合酶鏈反應)技術或任何其他技術的組合。

42、本發明的第五方面提供了一種重組細胞，其包含以上所述的構建體。利用本發明的重組細胞能夠快速有效地制備以上所述的分離的植物防御素多肽，且制備獲得的多肽能夠有效抑制真菌活性。本領域普通技術人員應當理解，可以采用基因工程中常用的細胞表達構建體。在本發明的一些實施方式中，所述重組細胞為大腸桿菌細胞。

43、本發明的第六方面提供了一種組合物，其包含以上所述的分離的植物防御素多肽，所述分離的植物防御素多肽包含與seq?id?no:1和/或seq?id?no:2所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

44、在本發明的一些優選實施方式中，組合物中還進一步包含農業上或藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

45、本發明的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。