本發明屬于分子生物學,具體涉及一種基于結縷草基因組序列開發的ssr標記引物及其應用。
背景技術:
1、結縷草(zoysia?willd.),為禾本科,屬于多年生草本植物。不同的結縷草種質資源在環境適應性、抗逆性、飼用性能等特性上差異明顯。我國結縷草分布范圍較廣,適應性強,可在荒漠以及鹽堿地等環境中生長,是世界上公認的優良的暖季型草坪草。
2、搞清楚物種的遺傳多樣性及遺傳背景是合理保護利用該資源的前提,分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記,是研究物質遺傳多樣性及遺傳背景的強大工具。雖然rapd、issr、srap等分子標記技術已在結縷草遺傳多樣性、遺傳連鎖圖譜和遺傳背景等方面得到了一些應用,但有關結縷草特異引物的報道較少,導致在研究結縷草遺傳多樣性和結縷草遺傳背景上的困難較大,育種進程緩慢。因此,豐富結縷草特異引物庫已成為當務之急。
3、簡單重復序列(ssr,simple?sequence?repeat)又稱為微衛星dna,是以2~6個核苷酸為基本單位的串聯重復序列組成的dna片段,長度大多為100~200個堿基對,具有分布廣泛,多態性豐富,重復性好,共顯性遺傳等特點,已被廣泛應用于種質資源遺傳多樣性及遺傳背景研究、品種鑒定、分子標記輔助育種等方面,是分子標記輔助育種首選標記之一。基因組測序(dna-seq)技術是利用高通量測序技術對組織或者細胞中的dna進行深度測序的技術,是一種在基因組水平上高通量、低成本分析基因表達差異的有效手段,高效率、高通量、低成本地獲得大量的轉錄本信息的主要手段。目前尚未見到利用基因組測序開發結縷草ssr標記的研究報道。
技術實現思路
1、本發明的目的在于提供一種基于結縷草基因組序列開發的ssr標記引物和對結縷草親緣關系的研究方法和品種的鑒定方法。
2、本發明提供了一種鑒定結縷草的ssr標記組合,所述ssr標記組合包括ssr01、ssr02、ssr03、ssr04、ssr05、ssr06、ssr07、ssr08、ssr09、ssr10、ssr11、ssr12、ssr13、ssr14、ssr15、ssr16、ssr17、ssr18、ssr19、ssr20、ssr21、ssr22、ssr23、ssr24、ssr25、ssr26、ssr27、ssr28、ssr29、ssr30、ssr31、ssr32、ssr33、ssr34、ssr35、ssr36、ssr37、ssr38和ssr39;
3、所述ssr01的重復單元為gcc,重復次數為5;
4、所述ssr02的重復單元為gga,重復次數為6;
5、所述ssr03的重復單元為gag,重復次數為6;
6、所述ssr04的重復單元為cct,重復次數為5;
7、所述ssr05的重復單元為ggt,重復次數為7;
8、所述ssr06的重復單元為gcg,重復次數為10;
9、所述ssr07的重復單元為gaa,重復次數為5;
10、所述ssr08的重復單元為gga,重復次數為7;
11、所述ssr09的重復單元為tgt,重復次數為7;
12、所述ssr10的重復單元為ctc,重復次數為8;
13、所述ssr11的重復單元為gag,重復次數為5;
14、所述ssr12的重復單元為ttc,重復次數為5;
15、所述ssr13的重復單元為cgc,重復次數為5;
16、所述ssr14的重復單元為tca,重復次數為8;
17、所述ssr15的重復單元為ggc,重復次數為7;
18、所述ssr16的重復單元為gcg,重復次數為7;
19、所述ssr17的重復單元為cgc,重復次數為5;
20、所述ssr18的重復單元為ctg,重復次數為7;
21、所述ssr19的重復單元為gca,重復次數為6;
22、所述ssr20的重復單元為ct,重復次數為22;
23、所述ssr21的重復單元為gag,重復次數為7;
24、所述ssr22的重復單元為agc,重復次數為5;
25、所述ssr23的重復單元為cca,重復次數為6;
26、所述ssr24的重復單元為ggc,重復次數為6;
27、所述ssr25的重復單元為gcg,重復次數為8;
28、所述ssr26的重復單元為tgc,重復次數為5;
29、所述ssr27的重復單元為cct,重復次數為5;
30、所述ssr28的重復單元為tc,重復次數為8;
31、所述ssr29的重復單元為gtg,重復次數為6;
32、所述ssr30的重復單元為gcc,重復次數為5;
33、所述ssr31的重復單元為gac,重復次數為7;
34、所述ssr32的重復單元為ccg,重復次數為5;
35、所述ssr33的重復單元為tac,重復次數為8;
36、所述ssr34的重復單元為cgg,重復次數為6;
37、所述ssr35的重復單元為tcagc,重復次數為5;
38、所述ssr36的重復單元為cctcag,重復次數為5;
39、所述ssr37的重復單元為tga,重復次數為5;
40、所述ssr38的重復單元為cgg,重復次數為5;
41、所述ssr39的重復單元為agg,重復次數為5。
42、本發明還提供了一組用于擴增上述技術方案所述ssr標記組合的引物組合,包括zj-ssr01、zj-ssr02、zj-ssr03、zj-ssr04、zj-ssr05、zj-ssr06、zj-ssr07、zj-ssr08、zj-ssr09、zj-ssr10、zj-ssr11、zj-ssr12、zj-ssr13、zj-ssr14、zj-ssr15、zj-ssr16、zj-ssr17、zj-ssr18、zj-ssr19、zj-ssr20、zj-ssr21、zj-ssr22、zj-ssr23、zj-ssr24、zj-ssr25、zj-ssr26、zj-ssr27、zj-ssr28、zj-ssr29、zj-ssr30、zj-ssr31、zj-ssr32、zj-ssr33、zj-ssr34、zj-ssr35、zj-ssr36、zj-ssr37、zj-ssr38和zj-ssr39;
43、所述zj-ssr01包括zj-ssr01-f和zj-ssr01-r,所述zj-ssr01-f的核苷酸序列如seq?id?no.1所示,所述zj-ssr01-r的核苷酸序列如seq?id?no.2所示;
44、所述zj-ssr02包括zj-ssr02-f和zj-ssr02-r,所述zj-ssr02-f的核苷酸序列如seq?id?no.3所示,所述zj-ssr01-r的核苷酸序列如seq?id?no.4所示;
45、所述zj-ssr03包括zj-ssr03-f和zj-ssr03-r,所述zj-ssr03-f的核苷酸序列如seq?id?no.5所示,所述zj-ssr03-r的核苷酸序列如seq?id?no.6所示;
46、所述zj-ssr04包括zj-ssr04-f和zj-ssr04-r,所述zj-ssr04-f的核苷酸序列如seq?id?no.7所示,所述zj-ssr04-r的核苷酸序列如seq?id?no.8所示;
47、所述zj-ssr05包括zj-ssr05-f和zj-ssr05-r,所述zj-ssr05-f的核苷酸序列如seq?id?no.9所示,所述zj-ssr05-r的核苷酸序列如seq?id?no.10所示;
48、所述zj-ssr06包括zj-ssr06-f和zj-ssr01-r,所述zj-ssr06-f的核苷酸序列如seq?id?no.11所示,所述zj-ssr06-r的核苷酸序列如seq?id?no.12所示;
49、所述zj-ssr07包括zj-ssr07-f和zj-ssr07-r,所述zj-ssr07-f的核苷酸序列如seq?id?no.13所示,所述zj-ssr07-r的核苷酸序列如seq?id?no.14所示;
50、所述zj-ssr08包括zj-ssr08-f和zj-ssr08-r,所述zj-ssr08-f的核苷酸序列如seq?id?no.15所示,所述zj-ssr08-r的核苷酸序列如seq?id?no.16所示;
51、所述、zj-ssr09包括zj-ssr09-f和zj-ssr09-r,所述zj-ssr09-f的核苷酸序列如seq?id?no.17所示,所述zj-ssr09-r的核苷酸序列如seq?id?no.18所示;
52、所述zj-ssr10包括zj-ssr10-f和zj-ssr10-r,所述zj-ssr10-f的核苷酸序列如seq?id?no.19所示,所述zj-ssr10-r的核苷酸序列如seq?id?no.20所示;
53、所述zj-ssr11包括zj-ssr11-f和zj-ssr11-r,所述zj-ssr11-f的核苷酸序列如seq?id?no.21所示,所述zj-ssr11-r的核苷酸序列如seq?id?no.22所示;
54、所述zj-ssr12包括zj-ssr12-f和zj-ssr12-r,所述zj-ssr12-f的核苷酸序列如seq?id?no.23所示,所述zj-ssr12-r的核苷酸序列如seq?id?no.24所示;
55、所述zj-ssr13包括zj-ssr13-f和zj-ssr13-r,所述zj-ssr14-f的核苷酸序列如seq?id?no.25所示,所述zj-ssr14-r的核苷酸序列如seq?id?no.26所示;
56、所述zj-ssr14包括zj-ssr14-f和zj-ssr14-r,所述zj-ssr14-f的核苷酸序列如seq?id?no.27所示,所述zj-ssr14-r的核苷酸序列如seq?id?no.28所示;
57、所述zj-ssr15包括zj-ssr15-f和zj-ssr15-r,所述zj-ssr15-f的核苷酸序列如seq?id?no.29所示,所述zj-ssr15-r的核苷酸序列如seq?id?no.30所示;
58、所述zj-ssr16包括zj-ssr16-f和zj-ssr16-r,所述zj-ssr16-f的核苷酸序列如seq?id?no.31所示,所述zj-ssr16-r的核苷酸序列如seq?id?no.32所示;
59、所述zj-ssr17包括zj-ssr17-f和zj-ssr17-r,所述zj-ssr17-f的核苷酸序列如seq?id?no.33所示,所述zj-ssr17-r的核苷酸序列如seq?id?no.34所示;
60、所述zj-ssr18包括zj-ssr18-f和zj-ssr18-r,所述zj-ssr18-f的核苷酸序列如seq?id?no.35所示,所述zj-ssr18-r的核苷酸序列如seq?id?no.36所示;
61、所述zj-ssr19包括zj-ssr19-f和zj-ssr19-r,所述zj-ssr19-f的核苷酸序列如seq?id?no.37所示,所述zj-ssr19-r的核苷酸序列如seq?id?no.38所示;
62、所述zj-ssr20包括zj-ssr20-f和zj-ssr20-r,所述zj-ssr20-f的核苷酸序列如seq?id?no.39所示,所述zj-ssr20-r的核苷酸序列如seq?id?no.40所示;
63、所述zj-ssr21包括zj-ssr21-f和zj-ssr21-r,所述zj-ssr21-f的核苷酸序列如seq?id?no.41所示,所述zj-ssr21-r的核苷酸序列如seq?id?no.42所示;
64、所述zj-ssr22包括zj-ssr22-f和zj-ssr22-r,所述zj-ssr22-f的核苷酸序列如seq?id?no.43所示,所述zj-ssr22-r的核苷酸序列如seq?id?no.44所示;
65、所述zj-ssr23包括zj-ssr23-f和zj-ssr23-r,所述zj-ssr23-f的核苷酸序列如seq?id?no.45所示,所述zj-ssr23-r的核苷酸序列如seq?id?no.46所示;
66、所述zj-ssr24包括zj-ssr24-f和zj-ssr24-r,所述zj-ssr24-f的核苷酸序列如seq?id?no.47所示,所述zj-ssr24-r的核苷酸序列如seq?id?no.48所示;
67、所述zj-ssr25包括zj-ssr25-f和zj-ssr25-r,所述zj-ssr25-f的核苷酸序列如seq?id?no.49所示,所述zj-ssr25-r的核苷酸序列如seq?id?no.50所示;
68、所述zj-ssr26包括zj-ssr26-f和zj-ssr26-r,所述zj-ssr26-f的核苷酸序列如seq?id?no.51所示,所述zj-ssr21-r的核苷酸序列如seq?id?no.52所示;
69、所述zj-ssr27包括zj-ssr27-f和zj-ssr27-r,所述zj-ssr27-f的核苷酸序列如seq?id?no.53所示,所述zj-ssr27-r的核苷酸序列如seq?id?no.54所示;
70、所述zj-ssr28包括zj-ssr28-f和zj-ssr28-r,所述zj-ssr28-f的核苷酸序列如seq?id?no.55所示,所述zj-ssr28-r的核苷酸序列如seq?id?no.56所示;
71、所述zj-ssr29包括zj-ssr29-f和zj-ssr29-r,所述zj-ssr29-f的核苷酸序列如seq?id?no.57所示,所述zj-ssr29-r的核苷酸序列如seq?id?no.58所示;
72、所述zj-ssr30包括zj-ssr30-f和zj-ssr30-r,所述zj-ssr30-f的核苷酸序列如seq?id?no.59所示,所述zj-ssr30-r的核苷酸序列如seq?id?no.60所示;
73、所述zj-ssr31包括zj-ssr31-f和zj-ssr31-r,所述zj-ssr31-f的核苷酸序列如seq?id?no.61所示,所述zj-ssr31-r的核苷酸序列如seq?id?no.62所示;
74、所述zj-ssr32包括zj-ssr32-f和zj-ssr32-r,所述zj-ssr32-f的核苷酸序列如seq?id?no.63所示,所述zj-ssr32-r的核苷酸序列如seq?id?no.64所示;
75、所述zj-ssr33包括zj-ssr33-f和zj-ssr33-r,所述zj-ssr33-f的核苷酸序列如seq?id?no.65所示,所述zj-ssr33-r的核苷酸序列如seq?id?no.66所示;
76、所述zj-ssr34包括zj-ssr34-f和zj-ssr34-r,所述zj-ssr34-f的核苷酸序列如seq?id?no.67所示,所述zj-ssr34-r的核苷酸序列如seq?id?no.68所示;
77、所述zj-ssr35包括zj-ssr35-f和zj-ssr35-r,所述zj-ssr35-f的核苷酸序列如seq?id?no.69所示,所述zj-ssr35-r的核苷酸序列如seq?id?no.70所示;
78、所述zj-ssr36包括zj-ssr36-f和zj-ssr36-r,所述zj-ssr36-f的核苷酸序列如seq?id?no.71所示,所述zj-ssr36-r的核苷酸序列如seq?id?no.72所示;
79、所述zj-ssr37包括zj-ssr37-f和zj-ssr37-r,所述zj-ssr37-f的核苷酸序列如seq?id?no.73所示,所述zj-ssr37-r的核苷酸序列如seq?id?no.74所示;
80、所述zj-ssr38包括zj-ssr38-f和zj-ssr38-r,所述zj-ssr38-f的核苷酸序列如seq?id?no.75所示,所述zj-ssr38-r的核苷酸序列如seq?id?no.76所示;
81、所述zj-ssr39包括zj-ssr39-f和zj-ssr39-r,所述zj-ssr39-f的核苷酸序列如seq?id?no.77所示,所述zj-ssr39-r的核苷酸序列如seq?id?no.78所示。
82、本發明還提供了上述技術方案所述ssr標記組合或上述技術方案所述引物組合在鑒定和/或區分結縷草品種中的應用。
83、本發明還提供了一種結縷草品種的鑒定方法,包括如下步驟:
84、提取結縷草基因組dna;使用上述技術方案所述的引物組合對所述結縷草基因組dna進行pcr擴增,得到pcr產物;將pcr產物進行丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管電泳;對電泳條帶進行分析。
85、本發明還提供了一種鑒定結縷草品種的試劑盒,所述試劑盒包括上述技術方案所述的引物組合。
86、本發明還提供了一種結縷草基因組芯片,所述結縷草基因組芯片含有上述技術方案所述ssr標記組合。
87、本發明還提供了上述技術方案所述ssr標記組合或上述技術方案所述引物組合或上述技術方案所述試劑盒或上述技術方案所述的結縷草基因組芯片在結縷草的親緣關系分析中的應用。
88、本發明還提供了上述技術方案所述ssr標記組合或上述技術方案所述引物組合或上述技術方案所述試劑盒或上述技術方案所述的結縷草基因組芯片在結縷草的母系溯源中的應用。
89、本發明還提供了上述技術方案所述ssr標記組合或上述技術方案所述引物組合或上述技術方案所述試劑盒或上述技術方案所述的結縷草基因組芯片在結縷草遺傳譜系分析和/或遺傳圖譜構建中的應用。
90、本發明還提供了上述技術方案所述ssr標記組合或上述技術方案所述引物組合或上述技術方案所述試劑盒或上述技術方案所述的結縷草基因組芯片在結縷草種質資源的保護和/或輔助育種中的應用。
91、有益效果:
92、本發明提供了一種鑒定結縷草的ssr標記組合,采用本發明提供的ssr標記組合對36份結縷草材料鑒定后可以確定它們之間的親緣關系,對不同材料進行區分,可以為未知新品種與已知品種之間的親緣關系分析和新品種鑒定提供技術支持。
93、本發明提供的ssr標記引物來自于結縷草基因組序列,引物的多態性豐富、擴增穩定、擴增條帶易于鑒定,是穩定存在的新標記,填補了結縷草基于基因組開發ssr引物的空白。