本發明屬于微生物發酵領域,具體的說是一種己二酰-7-adca的發酵控制方法及其應用。
背景技術:
1、β內酰胺類抗生素是全球應用最多、評價最好的一大類抗生素。β內酰胺類抗生素包括青霉素類和頭孢類兩大類,其中頭孢類抗生素具有更穩定的分子結構,更好的抗耐藥菌等優點。目前抗菌效果較好、價格低廉、應用廣泛的頭孢氨芐、頭孢拉定和頭孢羥氨芐均是由7-adca與不同側鏈結合而形成的。目前國內生產7-adca的方法包括兩種:第一種是,利用青霉素工業鹽通過化學法合成苯乙酰-7-adca,再用酶裂解生產7-adca。該方法生產成本較高、對環境污染大;第二種是,將頭孢菌素c菌種進行基因工程改造,使其不再產生頭孢菌素c,而產生氨基己二酰-7-adca,再用酶裂解生產7-adca。但氨基己二酰-7-adca的性質極易溶于水,提取過程較為復雜,能耗大。
2、cantwell等人在current?genetics(1990)17:213-221上首次將streptomycesclavuligerus的擴環酶(cefe)基因轉入到產黃青霉菌(penicillium?chrysogenum)中,并使擴環酶(cefe)在產黃青霉菌中得到表達,檢測到擴環酶的活性,但并沒有得到相應的頭孢類產物。
3、申請號為cn92112278.0的專利公開了一種制備7-adca的新的生物方法,是在培養轉入擴環酶(cefe)基因的產黃青霉菌時,培養基中加入己二酸,產黃青霉菌的菌體內會合成己二酰-6-apa,己二酰-6-apa在擴環酶的作用下會形成己二酰-7-adca,從而實現了改變產黃青霉菌的青霉素合成途徑,產黃青霉菌不再合成青霉素,而是主要合成己二酰-7-adca。該專利文獻未公開詳細具體的發酵方法和實現低成本產業化的可能性。
4、《7-adca與7-aca醫藥中間體》一文中,詳細介紹了兩種醫藥中間體的合成路線和現有市場情況。我國頭孢菌素的研究起步較晚。1990年哈爾濱制藥總廠投資建設了一套生產裝置,是我國唯一一家具有6-apa、7-aca、7-adca三大抗生素母核生產能力的制藥企業。華北制藥集團于1999年也開發出了半合成抗菌素中間體6-apa、7-adca。
5、綜上所述,現有技術中,關于己二酰-7-adca發酵方法研究報道比較少,繼續改進新的發酵增產工藝。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題,本發明提供了一種己二酰-7-adca發酵方法,該發酵控制工藝的主要改進和創新點如下:
2、(1)己二酰-7-adca發酵過程中不斷補加硫離子,在不同發酵周期控制不同硫離子濃度。
3、(2)己二酰-7-adca發酵過程中分2次補加亞鐵離子。
4、(3)己二酰-7-adca發酵過程中補加油脂類物質,以降低己二酸的消耗。
5、(4)己二酰-7-adca發酵周期中后期補充添加蛋白胨和甘油,以降低菌體死亡率,提高菌體繁殖量。
6、具體的,本發明發酵工藝所采用的技術方案如下:
7、(a)己二酰-7-adca產生菌構建及篩選:利用基因工程方法構建質粒pkace,該質粒含有amds篩選標記,產黃青霉菌pcbc啟動子序列,streptomyces?clavuligerus的擴環酶(cefe)基因,卡那霉素篩選標記。將pkace質粒轉入本公司篩選出的青霉素高產菌株——產黃青霉菌(penicillium?chrysogenum)b131536號中,通過搖瓶篩選得到己二酰-7-adca高產菌株p180302號。
8、(b)種子制備:本發明所述p180302菌株的菌種制備過程如下:配制米孢子營養液,并將該液體與小米按1:3比例混合后在消毒柜中100±2℃蒸20分鐘,將蒸好的米放在風扇口吹涼、搓散,將小米分裝入茄子瓶中(20g/瓶),將茄子瓶放入消毒柜121℃下滅菌30min,滅菌結束后涼至室溫。將p180302號菌株接種到小米孢子培養基中,在培養溫度為25±0.5℃,相對濕度40%~60%條件下避光培養6-8天。
9、上述米孢子營養液配方為:0.2-0.8%蔗糖,1.0-1.5%玉米漿,0.01-0.05%硫酸銨,0.001-0.005%磷酸二氫鉀,0.0004-0.002%硫酸鎂,用蒸餾水配制,將米孢子營養液的ph調節至6.8±0.2。
10、(c)種子罐培養:將培養好的米孢子按火焰接種的方法接種到2m3種子罐培養基中,在25±0.5℃、140-160rpm、罐壓為0.03-0.06mpa、通氣比1:0.6-1:1.0的條件下培養65-75小時,當種子罐中的菌絲含量約為25%時即可移種到發酵罐中。
11、上述種子罐培養基配方為:1.0-3.0%蔗糖,2.0-4.0%玉米漿,0.1-0.5%硫酸銨,0.05-0.3%碳酸鈣,用深井水配制,將種子培養基的ph調節至6.0±0.2。對種子罐進行實消,121℃下滅菌30min,利用循環水冷卻降至25±0.5℃。
12、(d)發酵罐培養:將培養好的種子罐種子液按20-30%接種量接種至6m3發酵罐培養基中,在25±0.5℃、110-140rpm、罐壓為0.03-0.06mpa、通氣比1:0.8-1:1.2的條件下培養。當發酵單位增長緩慢,菌絲有自融現象時立即終止培養。
13、上述發酵罐培養基配方為:0.2-0.4%麩質粉,3.0-6.0%玉米漿,0.3-0.8%硫酸銨,0.2-0.4%磷酸二氫鉀,0.1-0.3%硫酸鈉,0.001-0.003%硫酸錳,0.01-0.03%硫酸亞鐵,0.1-0.5%碳酸鈣,用深井水配制,將發酵培養基的ph調節至ph6.0±0.2,對發酵罐進行實消,121℃下滅菌30min,利用循環水冷卻降至25±0.5℃。
14、(e)發酵罐工藝控制措施:發酵罐培養過程中連續補入濃度為55%左右的葡萄糖溶液,發酵罐中葡萄糖殘量控制在0.1-0.5g/l;發酵罐培養過程中連續補入濃度為20%左右的己二酸鈉溶液,發酵罐中己二酸殘量控制在1-2.5g/l;發酵罐培養過程中連續補入濃度為30%左右的硫酸銨溶液,發酵罐中氨基氮殘量控制在0.1-0.3g/l;培養過程中連續補入濃度為20%左右的氨水,發酵罐的ph控制在6.4±0.5。
15、發酵過程中連續補入濃度為1%-25%的硫酸鈉溶液,發酵罐中硫離子濃度控制為:發酵周期1-60h,硫離子濃度0.5-1.5g/l;發酵周期61-120h,硫離子濃度1.0-2.5g/l;發酵周期121-放罐,硫離子濃度1.5-3.5g/l。上述硫酸鈉溶液濃度優選3%-20%,更優選5%-15%。上述硫酸鈉溶液可以用硫酸鉀或硫酸鎂替代。
16、發酵過程中分2次補入濃度為1%-15%的硫酸亞鐵溶液,補入方式為:發酵周期60-68h時補入終濃度為0.05-0.1g/l的亞鐵離子;發酵周期120-128h時補入終濃度為0.1-0.15g/l的亞鐵離子。上述硫酸亞鐵溶液濃度優選2%-10%,更優選4%-6%。上述硫酸亞鐵溶液可以用氯化亞鐵或檸檬酸亞鐵替代。
17、發酵過程中連續補入玉米油,補入后終濃度為0.01-0.5g/l。上述玉米油可以用豆油、葵花籽油或菜籽油等食用油脂類物質替代,通過申請人大量實驗發現,己二酰-7-adca發酵過程中補加油脂類物質,可以有效降低己二酸的消耗,節約發酵成本,提高發酵效率。
18、進一步的,在發酵周期中后期補充添加蛋白胨和甘油,可以降低菌體死亡和自溶率,提高菌體繁殖量。在發酵過程中,因為菌體因為多種因素,會有一定的死亡和自溶率,為了提高發酵效率,抑制菌體的死亡率也成為提高己二酰-7-adca發酵效率的考慮重點。
19、具體的,本發明通過流加方式補充;發酵周期60-68h時補入終濃度為0.05-0.1g/l的蛋白胨和甘油;發酵周期120-128h時補入終濃度為0.1-0.15g/l的蛋白胨和甘油。
20、由于采用了上述技術方案,本發明取得的技術進步和有益效果是:
21、在試驗過程中發現己二酰-7-adca產生菌在合成產物過程中對硫離子的需求非常顯著,雖然發酵過程中向發酵罐中補加硫酸銨溶液,在補充氨基氮的同時補充了硫離子,但硫酸銨提供的硫離子遠遠不夠,所以本發明在己二酰-7-adca發酵過程中增加了連續補入硫離子,并且在不同發酵周期控制不同的硫離子濃度,使己二酰-7-adca產生菌的產物合成能力達到最佳。在己二酰-7-adca發酵培養基中添加亞鐵離子,并且發酵過程中分2次補加亞鐵離子,使亞鐵離子保持一個相對穩定的濃度,亞鐵離子可以增加己二酰-7-adca合成過程中一些酶的活性,明顯促進己二酰-7-adca合成速度。在發酵過程中連續補入玉米油等油脂類物質可以顯著的降低前體己二酸被菌體代謝掉,提高己二酸作為前體合成己二酰-7-adca的利用率,提高發酵單位,節約成本。通過以上技術手段,使己二酰-7-adca產生菌合成產物的能力明顯增強,己二酰-7-adca發酵單位增長快,己二酰-7-adca的放罐效價達到38g/l以上,比使用本發明工藝前增加約50%;己二酸并入己二酰-7-adca的利用率達到80%,己二酸利用率比使用本發明工藝前增加了約20%,明顯降低了己二酰-7-adca的發酵成本。
22、使用本發明的發酵方法,己二酰-7-adca發酵單位明顯提高,己二酰-7-adca的產量大幅增加,顯著降低了己二酰-7-adca的發酵成本。