一種基于C/Dbox莖環結構的高效VLP載體及其遞送mRNA的方法與流程

本發明涉及生物，具體涉及一種基于c/d?box莖環結構的高效vlp載體及其遞送mrna的方法。

背景技術：

1、vlp(virus?like?particle)技術來源于慢病毒系統，可利用病毒的高親嗜性特性實現有效的細胞內遞送，遞送對象可為核酸、蛋白質或者核糖核蛋白(rnp)等。但是病毒在遞送核酸時，多數以dna形式遞送，且慢病毒所遞送的dna存在基因組隨機插入的情況，因此在遞送crispr/cas9系統時，cas9蛋白基因在體內存在時間較久，持續翻譯成cas9蛋白，會導致較大機率的“脫靶”效應(與原設計的基因剪切效應無關的基因剪切)。在實際臨床應用中，可將cas9以mrna或蛋白的形式瞬時遞送到人體中，以達到治療目的同時大幅降低脫靶效應。

2、現有技術中公開了將ms2噬菌體衣殼蛋白(ms2c)和慢病毒gag-pol蛋白融合后表達于vlp的內核中，利用莖環結構(stem?loop)可與ms2c蛋白特異性識別和結合的原理，將cas9蛋白mrna和stem?loop融合后，通過stem?loop與vlp內核中的ms2c特異性結合，將cas9蛋白mrna導入vlp內核；同時將針對特定基因的grna克隆至慢病毒穿梭質粒，最終組裝出攜帶有cas9?mrna和grna的類似慢病毒結構的vlp。vlp將cas9?mrna和grna遞送至靶細胞的胞質中，通過翻譯cas9蛋白，在靶細胞內發揮出crispr-cas9系統的基因編輯效果。但現有慢病毒載體遞送rna技術中的ms2c-stem?loop的組合特異性結合效率低，導致cas9?mrna遞送效率偏低。

3、l7ae蛋白是一種高度保守的蛋白質，屬于l7ae蛋白家族，它能夠結合核糖體中的特殊莖環結構c/d?box。本發明使用的vlp遞送技術是以慢病毒為載體骨架。將l7ae蛋白和慢病毒gagpol蛋白融合后表達于vlp的內核中。利用莖環結構c/d?box可與l7ae蛋白特異性識別和結合的原理，將cas9蛋白mrna和莖環結構c/d?box融合后，通過c/d?box與vlp內核中的l7ae特異性結合，將cas9蛋白mrna導入vlp內核；同時將針對特定基因的grna克隆至慢病毒穿梭質粒，最終組裝出攜帶有cas9?mrna和grna的類似慢病毒結構的vlp。vlp將cas9mrna和grna遞送至靶細胞的胞質中，通過短時間翻譯cas9蛋白，在靶細胞內發揮出crispr-cas9系統的“瞬時”基因編輯效果，提高了vlp載體的mrna遞送效率和crispr-cas9編輯效率。

技術實現思路

1、本發明的目的是提供一種基于c/d?box莖環結構的高效vlp載體及其遞送mrna的方法。

2、為實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：

3、一方面，本發明提供了一種基于c/d?box莖環結構的vlp載體，所述的vlp載體是通過將含有cas9-6×c/d?box序列的質粒、含有l7ae序列的質粒轉染入目的細胞制備而得，所述的cas9-6×c/d?box序列如seq?id?no:1所示。

4、seq?id?no:1:

5、gacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggaaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgactaaaccggtcttgcagcacatctatgaagaaagccgctactctgaatttatgatgctgcaggtcgactctagaaactatgaagaaagccgctactctgaatttatgatgctgcagtattcccgggttcattagatcctaaggtacctaattgcctagaaactatgaagaaagccgctactctgaatttatgatgctgcaggtcgactctagaaactatgaagaaagccgctactctgaatttatgatgctgcagtattcccgggttcattagatcctaaggtacctaattgcctagaaactatgaagaaagccgctactctgaatttatgatgctgcaggtcgactctagaaactatgaagaaagccgctactctgaatttatgatg

6、具體地，所述的含有l7ae序列的質粒的制備包括：將pms2m-ph-gag-pol-d64v質粒中ms2c基因替換為l7ae基因，l7ae-ph-gag-pol-d64v質粒上l7ae-gag-pol基因序列如seqid?no:3所示。

7、seq?id?no:3:

8、ggaggcggaggcggaggcggaggcatgtacgtgagatttgaggttcctgaggacatgcagaacgaagctctgagtctgctggagaaggttagggagagcggtaaggtaaagaaaggtaccaacgagacgacaaaggctgtggagaggggactggcaaagctcgtttacatcgcagaggatgttgacccgcctgagatcgttgctcatctgcccctcctctgcgaggagaagaatgtgccgtacatttacgttaaaagcaagaacgaccttggaagggctgtgggcattgaggtgccatgcgcttcggcagcgataatcaacgagggagagctgagaaaggagcttggaagccttgtggagaagattaaaggccttcagaagagccagaactatccgattgtgcagtccggactcagatctcgagctcaagcttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccgggatccatggactcgggccgggacttcctgaccctgcacggcctacaggatgatgaggatctacaggcgctgctgaagggcagccagctcctgaaggtgaagtccagctcatggaggagagagcgcttctacaagttgcaggaggactgcaagaccatctggcaggagtcccgcaaggtcatgcggaccccggagtcccagctgttctccatcgaggacattcaggaggtgcgaatggggcaccgcacggagggtctggagaagttcgcccgtgatgtgcccgaggaccgctgcttctccattgtcttcaaggaccagcgcaatacactagacctcatcgccccatcgccagctgatgcccagcactgggtgctggggctgcacaagatcatccaccactcaggctccatggaccagcgtcagaagctacagcactggattcactcctgcttgcgaaaagctgacaaaaacaaggacaacaagatgagcttcaaggagctgcagaacttcctgaaggagctcaacatccagcctcgagccgaattcaccctggccgccagggccagcgtgctgagcggcggcgagctggacaggtgggagaagatcaggctgaggcccggcggcaagaagaagtataagctgaagcacatcgtgtgggccagcagggagctggagaggttcgccgtgaaccccggcctgctggagaccagcgagggctgcaggcagatcctgggccagctgcagcccagcctgcagaccggcagcgaggagctgaggagcctgtacaacaccgtggccaccctgtactgcgtgcaccagaggatcgagatcaaggacaccaaggaggccctggacaagatcgaggaggagcagaacaagtccaagaagaaggcccagcaggccgccgccgacaccggccacagcagccaggtgagccagaactaccccatcgtgcagaacatccagggccagatggtgcaccaggccatcagccccaggaccctgaacgcctgggtgaaggtggtggaggagaaggccttcagccccgaggtgatccccatgttcagcgccctgagcgagggagccaccccccaggacctgaacaccatgctgaacaccgtgggcggccaccaggccgccatgcagatgctgaaggagaccatcaacgaggaggccgccgagtgggacagggtgcaccccgtgcacgccggccccatcgcccccggccagatgagggagccccgcggcagcgacatcgccggcaccaccagcaccctgcaggagcagatcggctggatgaccaacaacccccccatccccgtgggcgaaatctacaagaggtggatcatcctgggcctgaacaagatcgtgaggatgtacagccccaccagcatcctggatatcaggcagggccccaaagagcccttcagggactacgtggacaggttctacaagaccctgcgcgccgagcaggccagccaggaggtgaagaactggatgaccgagaccctgctggtgcagaacgccaaccccgactgcaagaccatcctgaaggccctgggacccgccgccaccctggaggagatgatgaccgcctgccagggcgtgggcggccccggccacaaggccagggtgctggccgaggccatgagccaggtgaccaacaccgccaccatcatgatgcagaggggcaacttcaggaaccagaggaagatggtgaagtgcttcaactgcggcaaggagggccacaccgccaggaactgccgcgcccccaggaagaagggctgctggaagtgcggcaaggagggccaccagatgaaggactgcaccgagaggcaggctaattttttagggaagatctggccttcctacaagggaaggccagggaattttcttcagagcagaccagagccaacagccccaccatttcttcagagcagaccagagccaacagccccaccagaagagagcttcaggtctggggtagagacaacaactccccctcagaagcaggagccgatagacaaggaactgtatcctttaacttccctcagatcactctttggcaacgacccctcgtcacaataaagatcggtggccagctgaaggaggccctgctggacaccggcgccgacgacaccgtgctggaggagatgagcctgcccggcaggtggaagcccaagatgatcggcggcatcggcggcttcatcaaggtgaggcagtacgaccagatcctgatcgagatctgcggccacaaggccatcggcaccgtgctggtgggacctacacctgtgaacatcatcggcaggaacctgctgacccagatcggctgcaccctgaacttccccatcagccccatcgagaccgtgcccgtgaagctgaagcccggcatggacggccctaaggtgaagcagtggcccctgaccgaggagaagatcaaggccctggtggagatctgcaccgagatggagaaggagggcaagatcagcaagatcggccccgagaacccctacaacacccccgtgttcgccatcaagaagaaggacagcaccaagtggaggaagctggtggacttcagggagctgaacaagaggacccaggacttctgggaggtgcagctgggcatcccccaccccgccggcctgaagaagaagaagagcgtgaccgtgctggacgtgggcgacgcctacttcagcgtgcccctggacgaggacttcaggaagtataccgccttcaccatccccagcatcaacaacgagacccccggcatccgctaccagtacaacgtgctgccccagggctggaagggcagccccgccatcttccagagcagcatgacaaagatcctggagcccttcaagaagcagaaccccgacatcgtgatctatcagtacatggacgacctgtacgtgggcagcgacctggagatcggccagcacaggaccaagatcgaggagctgaggcagcacctgctgaggtggggcctgaccacccccgacaagaagcaccagaaggagcccccattcctgtggatgggctacgagctgcaccccgacaagtggaccgtgcagcccatcgtgctgcccgagaaggacagctggaccgtgaacgacattcagaagctggtgggcaagctgaactgggccagccagatctaccctggcatcaaggtgaggcagctgtgcaagctgctgaggggcacaaaggctctgaccgaggtgatccccctgaccgaggaggccgagctggagctggccgagaacagggagatcctgaaggagcccgtgcacggcgtgtactacgaccccagcaaggacctgatcgccgagatccagaagcagggccagggccagtggacctaccagatctaccaggagcccttcaagaacctgaagaccggcaagtacgcccgcatgcgcggcgcccacaccaacgacgtgaagcagctgaccgaggccgtgcagaagatcaccaccgagagcatcgtgatctggggcaagactcctaagttcaagctgcccatccagaaggagacctgggagacctggtggaccgagtactggcaggccacctggattcccgagtgggagttcgtgaacacccctcccctggtgaagctgtggtatcagctggagaaggagcccatcgtgggcgccgagaccttctacgtggacggcgccgccaacagggagaccaagctgggcaaggccggctacgtgaccaacaagggccgccagaaggtggtgcccctgaccaacaccaccaaccagaagaccgagctgcaggctatctacctggccctgcaggactcaggcctggaggtgaacatcgtgaccgacagccagtacgccctgggcatcatccaggcccagcccgacaagagcgagagcgagctggtgaaccagatcatcgagcagctgatcaagaaggagaaggtgtacctggcctgggtgcccgcccacaagggcatcggcggcaacgagcaggtggacaagctggtgagcgccggcatcaggaagatcctgttcctggacggcatcgacaaggcccaggacgagcacgagaagtaccacagcaactggagggctatggctagcgacttcaacctgcctcccgtggtggctaaggagatcgtggccagctgcgacaagtgccagctgaagggcgaggccatgcacggccaggtggactgcagccccggcatctggcagctggtttgcacccacctggagggcaaggtgatcctggtggccgtgcacgtggcctccggctacatcgaggccgaggtgatccccgccgagaccggccaggagaccgcctacttcctgctgaagctggccggccgctggcccgtgaagaccatccacaccgacaacggcagcaacttcaccagcgccaccgtgaaggctgcctgctggtgggccggcatcaagcaggagttcggcatcccctacaacccccagtctcagggcgtggtggagagcatgaacaaggagctgaagaagatcatcggccaggtgagggaccaggccgagcacctgaagaccgccgtgcagatggccgtgttcatccacaacttcaagaggaagggcggcatcggcggctacagcgccggcgagaggatcgtggacatcatcgccaccgacatccagaccaaggagctgcagaagcagatcaccaagatccagaacttcagggtgtactacagggacagcaggaaccctctgtggaagggccccgccaagctgctgtggaagggcgagggcgccgtggtgatccaggacaacagcgacatcaaggtggtgcccaggaggaaggccaagatcatcagggactacggcaagcagatggccggcgacgactgcgtggcctccaggcaggacgaggactga

9、具體地，所述的含有cas9-6×c/d?box序列的質粒的制備包括：將pcmv-gfp質粒中的gfp到poly(a)之間的序列替換為atg+cas9序列+taa+6×c/d?box序列。

10、進一步地，所述的含有cas9-6×c/d?box序列的質粒的制備分兩步進行，先插入cas9序列，然后插入6×c/d?box序列，獲得pcmv-cas9-6×c/d?box質粒。

11、具體地，所述的目的細胞選自hek293、hek293-t、hek293-sf、te671中的一種。

12、進一步地，所述的目的細胞為hek293-t。

13、又一方面，本發明提供了一種利用上述的vlp載體遞送mrna的方法，包括以下步驟：

14、(1)目的細胞培養，換液，孵育；

15、(2)將含有cas9-6×c/d?box序列的質粒、含有l7ae序列的質粒、載有vsvg基因的包裝質粒、載有rev基因的包裝輔助質粒、plv-egfp-u3-sp.grna質粒與載有gag和pol基因的包裝輔助質粒共轉染目的細胞；

16、(3)離心，棄上清，濃縮，得到含外源目的mrna的vlp顆粒。

17、具體地，步驟(1)中換液為換成2％?fbsdmem；

18、具體地，步驟(1)中目的細胞培養具體為每孔中加入1.6e5個/cm2?hek-293t細胞，培養24h。

19、具體地，步驟(1)中所述的目的細胞選自hek293、hek293-t、hek293-sf、te671中的一種。

20、進一步地，步驟(1)中所述的目的細胞為hek293-t。

21、具體地，步驟(2)的轉染過程中按照總dna與pei的質量體積比為1：(1-5)的比例進行轉染。

22、進一步地，步驟(2)中總dna與pei的質量體積比為1：2。

23、具體地，步驟(2)中轉染6h后換液10％?fbsdmem，于72h收集上清。

24、具體地，所述的含有l7ae序列的質粒的制備包括：將pms2m-ph-gag-pol-d64v質粒中ms2c基因替換為l7ae基因，l7ae-ph-gag-pol-d64v質粒上l7ae-gag-pol基因序列如seqid?no:3所示。

25、具體地，所述的含有cas9-6×c/d?box序列的質粒的制備包括：將pcmv-gfp質粒中的gfp到poly(a)之間的序列替換為atg+cas9序列+taa+6×c/d?box序列，得到pcmv-cas9-6×c/d?box質粒。

26、具體地，步驟(2)中所述的載有vsvg基因的包裝質粒為pmd.2g質粒；

27、具體地，步驟(2)中所述的載有rev基因的包裝輔助質粒為prsv-rev質粒；

28、具體地，步驟(2)中所述的載有gag和pol基因的包裝輔助質粒為pmdlg/prre-d64v質粒。

29、進一步地，所述的質粒pmd.2g、prsv-rev、pcmv-cas9-6×c/d?box、plv-egfp-u3-sp.grna、l7ae-ph-gag-pol-d64v與pmdlg/prre-d64v的質量比為(6-8)：(4-9):(20-30):(20-30):(10-15):(10-15)。

30、再進一步地，所述的質粒pmd.2g、prsv-rev、pcmv-cas9-6×c/d?box、plv-egfp-u3-sp.grna、l7ae-ph-gag-pol-d64v與pmdlg/prre-d64v的質量比為7.2：5.77:25:25:12.5:12.5。

31、具體地，所述的pmd.2g和prsv-rev質粒來自于第三代慢病毒質粒。

32、具體地，所述的plv-egfp-u3-sp.grna的制備包括：向plv慢病毒穿梭質粒中插入egfp序列，向u3?region?of?3'ltr中插入序列u6?promoter序列，得到plv-egfp質粒，然后將aavs1?grna-f和aavs1?grna-r進行退火操作，得到一條aavs1?grna雙鏈，再用aar?i酶對plv-egfp質粒進行酶切，將aavs1grna雙鏈克隆至plv-egfp質粒，得到plv-egfp-u3-aavs1-sp.grna質粒。aavs1?grna序列為：ggggccactagggacaggat(seq?id?no:2)。

33、具體地，所述的pmdlg/prre-d64v的制備包括：將pmdlg-prre質粒pol區域的integrase基因的64位氨基酸gat(d)突變為gtt(v)。

34、具體地，步驟(3)中離心的轉速為25000rpm，離心的時間為1.5-2.5h。

35、進一步地，步驟(3)中離心的溫度為4℃，離心的時間為2h。

36、具體地，步驟(3)中濃縮具體為棄上清后加入原上清體積1/50的pbs，過夜溶解重懸。

37、又一方面，本發明提供了上述的vlp載體或上述的遞送mrna的方法在提高vlp載體的mrna遞送效率和cas9或cas9衍生物的編輯效率中的應用。

38、本發明的有益效果為：

39、本發明通過對蛋白-莖環結構組合的優化，篩選出特異性結合和遞送效率更高的l7ae-c/d?box組合，提高vlp載體的mrna遞送效率和crispr-cas9編輯效率。